感音神经性聋是一种常见疾病,严重影响患者的生活质量。尽管目前临床上治疗感音神经性聋的策略有很多,但这些治疗手段效果并不理想。因此,预防感音神经性聋对于解决感音神经性聋难题有着重要的意义。随着分子生物学技术的发展,明确耳蜗毛细胞损伤的分子调控网络,寻找有效防治耳聋的基因,成为未来感音神经性聋研究新方向。大多数感音神经性聋患者在听力上会表现为高频听力损失。高频听力损失在病理上对应着耳蜗底回外毛细胞的损伤。耳毒性药物或噪声处理大鼠或小鼠时,也会出现高频听力损失的现象,耳蜗外毛细胞损伤程度从顶回到底回逐渐加重。以上现象表明,耳蜗底回外毛细胞比顶回外毛细胞更易受损,然而其中的具体机制尚未阐明。了解不同部位外毛细胞易损性差异的机制有助于更好的理解外毛细胞损伤的机制,并为相应的预防和治疗提供理论基础。既往研究表明感音神经性聋的发生及发展与氧化损伤存在密切关系,耳毒性药物、噪声刺激及老龄化等因素均能使耳蜗活性氧水平上升,从而导致耳蜗外毛细胞损伤及死亡。在此基础上我们推断感音神经性聋高频听力损失更常见,可能与耳蜗不同部位外毛细胞对氧化损伤的敏感性不同有关,即耳蜗底回外毛细胞(高频声信号接收区)比顶回外毛细胞(低频声信号接收区)对耳毒性药物造成的氧化损伤具有更高的敏感性。目的:1.分离并捕获足够数量在形态上已经成熟的外毛细胞进行单细胞转录组测序。2.通过单细胞转录组测序技术分析顶底回外毛细胞基因表达差异,寻找可能与其易损性差异相关的基因。3.进一步研究候选基因与顶底回外毛细胞易损性差异的相关性,为外毛细胞的损伤的预防和治疗提供依据。方法:1.分离P9天SD大鼠耳蜗顶回和底回外毛细胞,采用显微操作法捕获顶回和底回外毛细胞。2.采用单细胞转录组测序技术分别对顶回和底回外毛细胞样本进行测序,分析测序结果并找到氧化还原相关基因。通过查阅文献,选定NOX2为后续实验基因,验证其与耳蜗高频易损性的关系。3.通过免疫荧光观察NOX2在健康大鼠耳蜗外毛细胞中的表达以及新霉素处理后其在耳蜗外毛细胞中的表达变化。4.体内使用DPI抑制NOX2蛋白功能后,通过ABR评估听力情况,基底膜铺片观察外毛细胞形态及损失情况来判断能否减轻新霉素导致的耳毒性。体外基底膜培养使用gp91 ds-tat抑制NOX2蛋白功能,通过DHE检测活性氧水平,cleaved caspase-3和TUNEL检测凋亡,基底膜铺片观察外毛细胞形态及损失情况来判断能否对新霉素导致的外毛细胞损伤产生保护作用。结果:1.分离并捕获顶回和底回外毛细胞通过分离不同日龄的SD大鼠外毛细胞,发现P9天SD大鼠适用于顶回和底回外毛细胞的研究。随着耳蜗骨螺旋板骨化程度的提高,基底膜能分离下的外毛细胞数量,尤其是底回外毛细胞数量急剧减少。P9天SD大鼠外毛细胞呈标准的圆柱状,在形态上与成年大鼠外毛细胞接近;且能分离下足够数量的顶回和底回外毛细胞用于转录组测序。采用出生后9天的SD大鼠,分离出顶回和底回外毛细胞。在倒置显微镜下观察并采用显微操作的方式,利用玻璃电极来捕获外毛细胞。我们共收集了3组顶回和3组底回外毛细胞,每组样本包含30个外毛细胞。2.单细胞转录组测序及生物信息学分析测序结果共检测到顶回外毛细胞有13392个转录本,底回外毛细胞检测到了13140个转录本,其中顶回和底回外毛细胞均表达的转录本有11245个,特定表达在顶回外毛细胞的转录本有2147个,特定表达在底回外毛细胞的转录本有1895个。通过统计学分析,顶回外毛细胞和底回外毛细胞差异表达基因共有107个,其中底回外毛细胞相对于顶回外毛细胞表达量升高的有52个,底回外毛细胞相对于顶回外毛细胞表达量下调的有55个。其中有7个基因与氧化还原相关。根据查阅的文献,我们认为NOX2与氧化还原的关系最为密切。因此我们将NOX2作为后续的研究对象。3.NOX2差异性上调与顶底回外毛细胞易损性差异的相关性正常情况下,NOX2在耳蜗外毛细胞有低水平的表达且在顶底回外毛细胞中的表达无明显差异。然而,在新霉素诱导后,NOX2在底回外毛细胞显著高表达。我们发现,抑制NOX2功能能够显著减轻新霉素诱导的大鼠听力下降和外毛细胞损伤。同时,DHE染色结果显示,NOX2来源的活性氧参与了新霉素导致的耳毒性。结论:通过本课题的研究,我们首次获得了大鼠顶回和底回外毛细胞的转录组数据,并对其进行了生物信息学分析。通过查阅相关文献,筛选出了在顶回和底回外毛细胞中与氧化还原相关的差异表达基因。并初步验证了NOX2基因在耳蜗外毛细胞中的表达及与高频易损性的关系,为耳蜗高频易损性提供了一个新的解释。本研究为后续深入探索顶回和底回外毛细胞之间的异同提供了数据支持,并为进一步认识耳蜗高频易损性奠定了基础。