癌症是目前医学界最难以治疗的疾病之一。癌症中异常增生的肿瘤细胞能够逐步破坏周围组织和器官的结构与功能,同时产生癌症痛等症状,对病人的生理及心理造成严重的影响。　　溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid,LPA)是由羟基丙三醇、磷酸盐基团以及长链脂肪酸三部分组成的简单脂类分子。近年来大量的研究报导证明LPA通过LPA1-5五种受体亚型参与了癌症细胞的抗凋亡、增殖和转移等活动,是调控癌症发展的重要分子。同时也有研究指出,LPA通过其LPA1受体也参与了外周痛觉信息的传递,特别在神经病理痛的产生中起到了重要的作用。　　外周神经损伤所导致的神经病理痛是癌症痛产生的主要机制之一。然而,作为在癌症发展的过程中以及在神经病理痛的形成中都起到关键调控作用的LPA,目前尚无相关报道证明它是否参与了癌症痛的产生。因此,本研究工作以大鼠胫骨骨髓腔内接种WALKER256乳腺癌细胞建立的骨癌痛模型为研究对象,采用行为学、形态学、分子生物学以及电生理的方法,观察了癌细胞对外周神经纤维的影响,以及LPA在形成的骨癌痛中所起的作用,并且进一步探讨了LPA在参与骨癌痛形成中所涉及的下游信号通路,为癌症痛的临床治疗提供了可能的理论依据。　　1.骨癌模型及相关行为学和形态学变化　　临床骨癌病例最明显的特征就是骨内癌细胞对骨质的破坏,以及产生严重的骨癌痛。骨癌模型动物的X光影像分析表明,在接种肿瘤细胞16天后,骨癌大鼠的胫骨内就已经出现了明显的骨质损伤。胫骨随着癌症的发展会产生明显的变形,术后25天后整个骨头变得非常脆弱,甚至发生骨折。　　vonFrey机械刺激诱导的骨癌痛从术后第7天开始出现,机械阈值由术前的15.88±2.36g变为8.00±1.03g,术后第16天痛敏达到最高峰,阈值降低到4.68±0.79g。通过对1g到16g之间不同强度机械刺激的反应情况进行对比,骨癌大鼠不仅对能引起正常动物痛行为的高强度机械刺激(≥15g)产生了痛觉过敏,同时对原本不能引起正常大鼠痛行为的低强度机械刺激(＜15g)也变得敏感,形成了触诱发痛现象,说明骨癌大鼠外周支配皮肤神经中的A纤维与C纤维都受到癌症细胞的影响发生了敏化。本研究选择术后16天左右的大鼠进行进一步骨癌痛机制研究。　　2.骨癌大鼠的外周神经纤维损伤及其电生理特性　　通过形态学和电生理的方法来观察癌症细胞对外周神经纤维的影响。免疫组化观察外周神经损伤标志物激活转录因子3(activatingtranscriptionfactor3,ATF3)的表达,结果显示在骨癌大鼠术侧腰4、腰5节段的背根节(dorsalrootganglia,DRG)神经元胞体中,ATF3表达量上调(每片DRG切片ATF3阳性细胞表达量比较:骨癌组=14.45,假手术组=2.02),说明骨癌大鼠外周神经纤维上发生了损伤。　　大鼠后关节囊神经与腓肠神经分别为支配胫骨骨髓腔和支配小腿及脚掌外侧皮肤的神经纤维,它们分别代表了骨内神经纤维与骨外神经纤维。在体记录骨癌大鼠后关节囊神经与腓肠神经的多单位动作电位发放,结果显示后关节囊神经受骨内肿瘤细胞直接作用后,平均自发放电频率大大降低(骨癌组=O.16Hz,假手术组=0.97Hz),且对骨髓腔内机械或辣椒素刺激的敏感性也由术前的100％降低到仅剩28.6％。然而腓肠神经在受骨内肿瘤细胞间接影响后,自发放电频率显著升高(骨癌组=0.75Hz,假手术组=0.28Hz)。　　通过首次建立的离体腓肠神经-脚掌皮肤的电生理实验进一步观察肿瘤细胞对外周皮肤神经的敏化作用。结果显示,在有少部分腓肠神经纤维发生坏死而失去电生理兴奋能力的同时,未受损的神经纤维兴奋性增强,其中A纤维与C纤维均表现出更高的自发放电比例(Acancer=52.11％,Ccancer=28.57％,Asham=33.85％,Csham=22.58％)。　　这些结果在进一步的证明了行为学实验结果的同时,更说明了骨癌对于其支配范围内神经纤维和邻近的支配区外神经纤维的影响是不一样的,肿瘤细胞直接作用于支配区内的神经纤维,可能通过机械压迫和酶解等手段造成了大量的神经纤维坏死:对于支配范围外的神经纤维,肿瘤细胞则可能通过间接的作用使其产生敏化,从而表现出机械刺激皮肤引起的痛敏。　　3.LPA参与骨癌大鼠的外周神经纤维敏化　　LPA是肿瘤细胞大量释放的物质之一,对癌症发展及神经损伤都起到重要的调控作用,因此,我们进一步通过分子生物学及电生理的方法来观察LPA在肿瘤细胞引起的外周神经敏化中所扮演的角色。　　Westernblot观察外周DRG中LPA1受体的表达,结果显示骨癌动物DRG的LPA1表达量上调,说明LPA及其LPA1受体确实参与了癌症引起的外周神经系统的生理性变化。　　在建立的离体标本中,首先清洗掉标本中的血液,去除胫骨,从而排除掉血小板和肿瘤细胞这两个LPA的主要来源,然后再给予标本外源性的LPA,能够引起腓肠神经单纤维上动作电位发放,且该反应在骨癌大鼠中的敏感要远远高于假手术大鼠,其中C纤维的变化尤为明显(骨癌组=81.25％,假手术组=22.22％)。说明癌症引起了LPA对于外周神经纤维的刺激性增强,进一步的证明了LPA参与骨癌痛的产生。　　LPA1受体是LPA表达于外周神经系统中的主要受体亚型,同时有报导指出P物质(substanceP,SP)及其受体NK-1参与了LPA引起的疼痛。我们将离体骨癌标本提前给予LPA1受体拮抗剂VPC32183或者NK-1受体拮抗剂WIN51708,均能够抑制LPA诱导的动作电位发放,说明LPA通过LPA1以及NK-1受体信号通路来参与肿瘤细胞引起的骨癌痛外周机制。　　综上所述,本研究结论如下:(1)肿瘤细胞引起的外周神经损伤所导致的神经病理痛,是癌症痛的重要机制之一。(2)作为癌症发展与神经病理痛形成的重要调控物LPA,通过LPA1以及NK-1信号通路参与了癌症痛的形成。