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目的全球范围内肝细胞癌(H epatocellular carcinoma,HCC)的发病率居所有肿瘤的第五位,其中80%的HCC病例集中在亚洲地区[1]。尽管随着手术技术的改进和各种介入与生物治疗的进展使得肝癌的疗效得到一定程度的改善,但是其总体预后仍不能令人满意。目前研究认为肝癌组织中小部分肿瘤干细胞的存在是肝癌易转移和复发的根源。肿瘤干细胞是一群具有体外自我更新、侵袭转移及放化疗抵抗等“干性”生物学特征的肿瘤细胞[2]。许多研究发现肝癌干细胞(h epatic CSCs)具有不同的表面标记,其中主要是表面抗原分化簇(cluster of differentiation,CD)家族成员C D133、CD90、CD44、CD24与CD13等。目前为止,肝癌中没有广泛被接受的肝癌干细胞表面标记物分子。新近研究发现C D44是常见的肝癌干细胞的表面标记物,在肝癌的侵袭转移过程中起重要作用[3]。然而C D44分子在转录翻译的过程中因为选择性的剪接作用可产生许多变体分子如C D44s、CD44v6、CD44v7-8、CD44v10等,其中CD44v6被证实与许多肿瘤的侵袭转移密切相关[4]。那么,在肝细胞癌中究竟哪种C D44变体适合作为其“干性”标记。本研究拟首先在C D44众多变体分子中筛选并验证CD44v6是否可作为肝癌干细胞的表面标记。众所周知,肿瘤干细胞“干性”的维持依赖于信号通路的调控,而一些研究表明c-Met信号通路可能参与肿瘤干细胞“干性”的维持[5,6]。因此,本研究将进一步采用c-Met信号通路抑制剂阻断CD44v6+肝癌干细胞的c-Met信号通路,观察其“干性”生物学行为的变化,旨在探讨c-Met信号通路在CD44v6+肝癌干细胞“干性”维持中的作用和机制。方法(1)采用流式细胞术对肝癌细胞系(P LC/PRF/5、MHCC-97H、MHCC-97L、SNU398、LM3、SK-hep-1)进行流式表型分析,测定各细胞系表面CD44s、CD44v6、CD44v7-8、CD44(CD44总体分子抗体既能识别CD44s分子又能识别C D44变体分子)分子的表达情况。(2)根据流式分析结果,选取P LC/PRF/5细胞系作为CD44的分选细胞系,进行磁珠分选,得到C D44+/CD44-细胞;选取SNU398、MHCC-97H作为CD44v6的分选细胞系,进行磁珠分选,得到CD44v6+/CD44v6-细胞。(3)对分选出的C D44+/CD44-,CD44v6+/CD44v6-细胞进行浮球实验、平板克隆实验、T ranswell侵袭和转移实验、索拉菲尼耐药实验、裸鼠体内成瘤实验等一系列“干性”鉴定实验,以确定肝癌干细胞合适的表面标记物。(4)将分选出的C D44v6+和CD44v6-细胞分别建立小鼠体内侵袭转移模型,观察CD44v6+/CD44v6-细胞侵袭转移能力的差异。(5)将从S NU398细胞系分选得到的CD44v6+细胞分为两组,一组为CD44v6+空白组,另一组为C D44v6+PHA组(用PHA665752抑制剂处理24小时);从S NU398细胞系分选得到的CD44v6-细胞分为两组,一组为CD44v6-空白组,另一组为C D44v6-PHA组(用PHA665752抑制剂处理24小时)。(6)用W estern Blotting检测上述四组细胞c-Met、p-Met、AKT和p-AKT蛋白水平的表达,观察P HA665752对CD44v6+/CD44v6-细胞c-Met信号通路的抑制效应。(7)T ranswell实验检测上述四组细胞的侵袭迁移能力,同时用Western Blotting检测上述四组细胞中干性基因N anog、Oct4、Sox2和c-Myc的表达状况,观察P HA665752阻断c-Met信号通路后对CD44v6+/CD44v6-细胞“干性”特征的影响。(8)进一步采用W estern Blotting检测上述四组细胞EMT相关分子E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist1的表达水平,拟验证PHA665752阻断CD44v6+/CD44v6-细胞c-Met信号通路后其转移能力的变化。(9)采用免疫组织化学方法分别检测15对人肝癌组织中癌和癌旁组织中CD44v6、Nanog、c-Met和p-Met的表达情况,分别对其进行染色强度和面积评分,分析C D44v6与其它指标的关系。结果(1)CD44、CD44s、CD44v6、CD44v7-8在不同肝癌细胞系中的表达情况:CD44与C D44s的表达在细胞系中的表达量几乎都高达90%,CD44v7-8在各肝癌细胞系中几乎不表达,C D44v6的表达与肝癌细胞系的侵袭程度呈正相关。最后选择P LC/PRF/5作为CD44的分选细胞系,SNU398和MHCC-97H作为CD44v6的分选细胞系。(2)分选的CD44+/CD44-细胞组肝癌干细胞鉴定实验结果:A浮球培养实验:显示分选出的C D44+与CD44-细胞具有相似的自我更新能力;B平板克隆实验:C D44+与CD44-细胞相比克隆形成能力几乎相同;C体外成瘤实验:C D44+和CD44-细胞在体外的成瘤能力无明显差异;D Transwell迁移侵袭实验:C D44+和CD44-细胞迁移侵袭能力相同;E化疗药物抵抗实验:分选出的C D44+较CD44-细胞没有显示更强的抵抗化疗药物的能力。同样,我们对C D44v6+/CD44v6-肝癌细胞也进行了上述干性鉴定试验,结果如下:A浮球培养实验:显示分选出的CD44v6+较CD44v6-细胞具有更强的自我更新能力(p<0.05);B平板克隆实验:CD44v6+与CD44v6-细胞相比克隆形成能力更高(p<0.05);C Transwell迁移和侵袭实验:CD44v6+细胞在迁移和侵袭方面的能力较C D44v6-细胞更强(p<0.01,p<0.05);D体外成瘤实验:C D44v6+细胞的成瘤能力明显强于CD44v6-细胞(p<0.05);E化疗药物抵抗实验:分选出的CD44v6+较CD44v6-细胞有更强的抵抗化疗药物的能力(p<0.05)。(3)NOD/SCID小鼠体内侵袭转移模型结果:45天后处死CD44v6+和CD44v6-两组小鼠,并将小鼠肝脏和肺脏可疑部位进行H E切片染色。HE切片显示在C D44v6+细胞组中在小鼠的肝脏部位形成了远处转移灶,而CD44v6-细胞组中没有远处转移灶的形成。(4)Western Blotting检测c-Met信号通路的关键分子,结果显示:CD44v6+空白组中p-Met的表达明显高于CD44v6-空白组(p<0.05),CD44v6+空白组中p-Met、p-Akt的表达明显高于CD44v6+PHA组(p<0.05)。(5)Western Blotting检测干性相关基因,结果显示:CD44v6+空白组干性基因Nanog、c-Myc的表达明显高于CD44v6-空白组(p<0.05),CD44v6+空白组中N anog、Oct4、c-Myc的表达明显高于CD44v6+PHA组(p<0.05)。Transwell侵袭和迁移实验显示抑制c-Met信号通路后CD44v6+和CD44v6-细胞组的侵袭和迁移能力均下降。(6)Western Blotting检测EMT相关基因的表达,结果显示:CD44v6+空白组中V imentin、Twist1的表达明显高于CD44v6-空白组(p<0.05),CD44v6+空白组S nail、Twist1的表达明显高于CD44v6+PHA(p<0.01)。(7)根据评分结果进行Fisher精确检验,发现在临床组织标本中CD44v6的表达与p-Met的表达明显相关(p<0.05)。结论(1)CD44不适合作为肝癌干细胞的表面标记,CD44v6可作为肝癌干细胞表面标记,且与肝癌的侵袭转移相关。(2)c-Met信号通路在CD44v6+细胞中的活化程度明显高于CD44v6-细胞组,并且抑制C D44v6+肝癌干细胞c-Met信号通路后,CD44v6+肝癌干细胞的“干性”特征丧失、相关干性基因的表达下调,提示c-Met信号通路可能参与C D44v6+肝癌干细胞“干性”特征的维持。(3)抑制CD44v6+细胞中c-Met信号通路后,CD44v6+肝癌干细胞的迁移侵袭能力下降,并且C D44v6+细胞中Snail、Twist1的表达也下降,c-Met信号通路参与维持C D44v6+细胞的干性生物学行为,并进一步促进EMT,与肝癌的侵袭转移行为密切相关。(4)在肝癌临床组织标本中进一步验证了CD44v6与c-Met信号通路的激活存在相关性。