血吸虫病(Schistosomaisis)是一种对人类健康危害严重的人兽共患寄生虫病，流行于亚洲、非洲和美洲的76个国家和地区。在我国只有日本血吸虫病(Schistosomiasis japonica)流行，其病原体是日本血吸虫（Schistosoma japonicum），中间宿主是钉螺（Oncomelanica hupensis），现有的疫区主要分布于长江流域的江西、湖南、湖北、安徽、江苏5省的湖滩地区，防治难度较大。2010年估计，全国的血吸虫感染人数约有36.2万左右。因此，血吸虫病防治仍然是我国主要公共卫生问题之一。　　 目前，血吸虫病防治面临亟待解决的主要科技问题是高效环保的消灭钉螺的药物、具有疗效考核价值的快速实用型诊断技术和血吸虫病疫苗的研发。随着血吸虫病防治工作的深入，以“依靠政府大力投入的综合性”防治模式必将被以“免疫预防加早期诊治”的防治模式所替代，以实现血吸虫病防治工作的可持续发展。近20多年，充分应用现代生物技术开展疫苗研究已成为血吸虫病基础的热点和学科前沿，并取得了长足的进步，如获得了一批具有免疫保护力的免疫候选分子如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等，但是，迄今为止，研制的疫苗都未能诱导宿主产生稳定的高于40％（WHO建议）的保护力，仍然没有一个能应用于现场防治的商品化疫苗，且大多数的研究主要是有关曼氏血吸虫病疫苗研究。其中，对血吸虫与宿主免疫系统相互作用机制尤其是血吸虫免疫逃避机制的认识不足可能是其重要的原因之一。因此，迫切需要科研工作者在防治理论和关键技术方面进行创新和突破。　　 寄生虫侵入免疫功能正常的宿主体内后，能逃避宿主的免疫效应攻击而继续生存、发育、繁殖，这种现象称为免疫逃避(immune evasion)。免疫逃避是寄生虫在宿主体内赖以长期生存的重要手段，是寄生虫作为复杂生物体的一种天然的逃避行为，是在与易感宿主长期相互适应、共同进化过程中形成的，表现为一切成功寄生虫感染的基本特征，也是寄生虫感染免疫的重要特点之一。随着对血吸虫免疫逃避机制研究的深入，虫源性免疫调节分子主动调节宿主免疫应答，特别是抑制宿主免疫细胞的功能和主动的改变宿主体内细胞因子的应答状况，已经被认为是血吸虫免疫逃避机制的一个重要的途径，越来越受到关注。目前研究已经发现和鉴定了一些虫源性的免疫调节分子，主要为一些蛋白酶类、蛋白酶抑制剂类和糖蛋白类，具有免疫调节功能的小分子量蛋白物质发现尚少，仅有Sm16，HSP60，Sj16等几种，但对虫源性特殊的免疫调节分子的功能和确切机制的研究也尚不清楚。对这些虫源性特殊的免疫调节分子主动调节宿主免疫应答机制的研究，特别是虫源性分子调节某些细胞因子表达的机制具有重要的意义。　　 Sj16是本课题组首次从日本血吸虫成虫文库中鉴定出的编码16kDa蛋白的新基因。自1999年以来，本课题组对该基因进行了较系统的研究，建立了基于pGEX-4T-1的高效原核表达体系，实现了重组Sj16蛋白(rSj16)的可溶性表达。体内实验证明rSj16不同剂量腹腔注射能治疗大鼠佐剂性关节炎;明显减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和降低毛细血管的通透性;明显抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀;亦可明显降低实验性腹膜炎小鼠腹腔毛细血管通透性，且具有剂量依赖关系的抗炎活性。而体外实验也表明rSj16能抑制LPS诱导的树突状细胞的成熟、并明显下调IL-12的表达、上调IL-10的表达;能抑制LPS诱导的Raw264.7（小鼠巨噬细胞株）产生NO和向M1方向分化;能抑制JCS细胞（小鼠白血病来源淋巴细胞株）的增殖和分化;能促使na(i)ve T细胞向Th2细胞方向分化;能诱导调节性T细胞（Treg细胞）的增加。提示rSj16具免疫负调节作用，可能是一个与血吸虫免疫逃避相关的重要分子。此外，我们的研究也发现rSj16对各种免疫细胞作用的一个重要的共同特征就是:rSj16能明显诱导抗原递呈细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）和Treg细胞高表达IL-10，提示rSj16发挥免疫负调节作用的机制可能与诱导IL-10表达密切相关。但是IL-10是否在rSj16发挥免疫负调特别是负调DC功能中起决定性作用，以及rSj16是如何调节免疫细胞高表达IL-10的分子机制目前仍不清楚。　　 研究目的和意义:　　 本研究在前期工作基础上，重点探讨rSj16发挥免疫负调特别是负调DC与IL-10之间的关系，并对rSj16负调DC上调IL-10的关键结构域进行分析和筛选，以期为揭示探讨rSj16免疫负调的机制提供依据。　　 研究方法和内容:　　 1.rSj16负调树突状细胞功能与IL-10关系研究　　 分离和培养C57BL/6J小鼠(WT) BMDC，利用anti-IL-10 Ab抑制IL-10产生、anti-IL-10R Ab封闭IL-10 R抑制IL-10的功能观察rSj16作用后对LPS诱导的BMDC表面分子表达和细胞因子分泌的影响;进一步通过分离IL-10（-/-)小鼠BMDC观察IL-10与rSj16负调LPS诱导的DC功能之间的关系，验证rSj16对LPS诱导的BMDC的负调作用是否是IL-10依赖性的。　　 2.rSj16上调树突状细胞IL-10表达负调DC功能的机制研究　　 2.1、rSj16上调树突状细胞IL-10表达负调DC功能与DC膜上受体之间的关系　　 分别分离和培养C57BL/6小鼠(WT)、TLR4-/-小鼠和TLR2-/-小鼠骨髓来源的树突状细胞，观察rSj16对LPS诱导的BMDC表面分子表达和细胞因子分泌的影响;同时利用rSj16负载的LPS诱导的BMDC体内刺激na(i)ve小鼠，检测小鼠脾脏细胞因子的表达水平，观察体内诱导Na(i)ve小鼠发生抗原特异性免疫应答的类型，探讨rSj16对LPS诱导的BMDC负向调节功能与DC膜上受体TLR4或TLR2相关性。　　 2.2、rSj16上调树突状细胞IL-10表达负调DC功能与核定位序列之间的关系　　 利用生物信息学方法对Sj16进行结构域分析，确定其具有两段核定位序列(NLS1和NLS2)。构建pEGFP-N1-Sj16重组质粒及5段核定位序列的突变体质粒并转染HeLa细胞，观察pEGFP-N1-Sj16及各个突变体在HeLa细胞上的定位情况，观察核定位序列对Sj16在HeLa细胞内定位的影响。在确定NLS1为有效的核定位序列之后，进一步构建pGEX-4T-1-rSj16及3个pGEX-4T-1-rSj16突变体，在E.coil中获得rSj16及3个rSj16突变体的纯化蛋白。利用NHS-Flurescein标记rSj16及3个rSj16蛋白，激光共聚焦显微镜观察同一时间内rSj16和3个rSj16突变体在BMDC中的定位情况。同时观察rSj16和3个rSj16突变体对BMDC表面分子表达及细胞因子表达的影响，从而评价核定位序列在rSj16上调树突状细胞高表达IL-10中的作用，从而探讨核定位序列在rSj16负调LPS诱导的BMDC中的作用。　　 3.统计学分析　　 有关数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量检测结果以均数±标准差（x±s）表示，P＜0.05表示有统计学差异。　　 研究结果与讨论:　　 1.rSj16负调树突状细胞功能是IL-10直接依赖并通过IL-10R发挥作用　　 我们首先利用抗IL-10抗体尝试对BMDC产生的IL-10进行封闭，结果提示IL-10封闭后，rSj16抑制LPS诱导的BMDC表面分子MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86的表达和分泌IL-12的的能力明显下降，证明rSj16负调DC功能与促进IL-10产生直接相关，抑制IL-10产生，rSj16功能得到抑制。同时进一步利用抗IL-10受体抗体封闭IL-10受体，IL-10受体封闭后，IL-10R依赖的途径得到了抑制，IL-10的功能受到抑制。此时，虽然加入rSj16后，但是LPS诱导的BMDC表面分子MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86的表达和分泌IL-12不能得到抑制，提示rSj16负调DC功能是通过IL-10R依赖的途径发挥作用的。为了进一步证明rSj16作用是否是IL-10依赖的，本研究利用IL-10-/-小鼠观察rSj16对LPS诱导的BMDC的功能的影响，结果显示，将IL-10基因敲除后，无论是LPS还是rSj16均不能引起IL-10的产生。同时相比WT小鼠，LPS可以促进KO小鼠BMDC产生更多的IL-12，这与其他人的报道关于IL-10可以抑制IL-12产生一致。令人吃惊的是，完全失去IL-10后，rSj16抑制LPS诱导BMDC成熟的能力完全消失，在KO小鼠上，LPS组与LPS+rSj16组BMDC表面分子MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86的表达和分泌IL-12的水平没有显著性差异，证明rSj16负调DC的功能是通过促进IL-10产生来发挥的。综上所述，rSj16负调DC功能是IL-10直接依赖的并通过IL-10R通路来发挥作用。　　 2.rSj16负调LPS诱导的BMDC功能是膜上受体TLR4和TLR2非依赖的　　 在TLR4(-/-)或TLR2(-/-)中，相比与对照组，LPS组仅能诱导BMDC表达较低水平的MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD40，而rSj16作用则仍然可以下调TLR4(-/-)或TLR2(-/-)来源的BMDC表面分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD40的表达。同时rSj16作用仍然可以促进TLR4(-/-)或TLR2(-/-)小鼠来源的BMDC高表达IL-10和抑制其表达IL-12，其作用趋势与rSj16作用在WT小鼠BMDC上一致。rSj16负载的TLR4(-/-)或TLR2(-/-)小鼠来源的BMDC同样可以剂量依赖性的抑制脾细胞IFN-γ的分泌，促进IL-10的分泌。综上所述，rSj16通过高表达IL-10负调DC功能可能是膜上受体TLR2和TLR4非依赖的。　　 3.rSj16负调LPS诱导的BMDC上调IL-10与核定位序列相关　　 通过生物信息学分析，提示Sj16存在两段核定位序列。其中NLS1(N端的NLS)具有真正的诱导rSj16入核的能力，是真正的核定位序列。NLS1具有三簇碱性氨基酸，是一种新型的非经典的双分型的NLS，其与rSj16负调DC上调IL-10的功能相关。　　 研究结论:　　 1.rSj16负调LPS的BMDC功能是IL-10直接依赖的并通过IL-10R通路来发挥作用。　　 2.rSj16负调LPS的BMDC上调IL-10的作用是TLR4和TLR2非依赖性的。　　 3.rSj16存在一段有效的非经典的核定位序列NLS1，其可以引导rSj16靶向核内，是rSj16发挥负调LPS的BMDC上调IL-10表达功能的关键结构域。　　 创新性:　　 (1)首次证实日本血吸虫分泌的具有抗炎作用的蛋白分子(Sj16)主要是通过上调抗原递呈细胞的IL-10表达，从而调节宿主的Th细胞应答。　　 (2)首次证实核定位序列是rSj16上调树突状细胞高表达IL-10的关键序列。　　 (3)本研究发现了血吸虫负调宿主免疫应答的新模式，进一步揭示了血吸虫与宿主相互作用的精细机制。