论文部分内容阅读
设施农业的兴起和快速发展,解决了我国长期以来蔬菜供应不足的困境,但也不可避免地带来了一些问题,如设施内特定环境引起的病虫害高发和连作障碍,以及由于农药过量施用引起的农药残留超标等。因此,寻求一种绿色高效、简便易行且能够大规模应用的农药残留消除技术和方案显得尤为迫切。油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是一种调控植物生长发育和抗逆性的新型植物激素,并且能够通过激活解毒代谢基因促进异源化合物降解,但内在的调控机制尚不明确。TGA转录因子是bZIP转录因子(basic region-leucine zippers)家族成员,是植物中最早鉴定到的一类转录因子,因其结合基因启动子的TGACG序列而得名。TGA转录因子参与植物的抗病防御、生长发育以及对有毒代谢产物的解毒代谢等多个过程,但其在农药残留代谢降解中的作用尚未见报道。番茄是设施园艺栽培面积最大的蔬菜,本文选择番茄作为实验材料,利用转基因技术,结合分子生物学和植物生理学手段,研究TGA转录因子在BR促进广谱杀菌剂百菌清(Chlorothalonil,CHT)植物体内代谢降解的作用,并研究TGA2转录因子的氧化还原修饰对其调控解毒代谢基因表达和农药残留代谢降解的影响。结果如下:1.明确了番茄中有四个Class Ⅱ TGA转录因子,其中TGA2、TGA2.2和TGA2.3参与了番茄植株对百菌清残留的降解过程。TGA2蛋白能够直接结合谷胱甘肽S-转移酶(GlutathioneS-transferase,GST)编码基因GST3的启动子并促进其转录。利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)TGA蛋白序列进行Blast比对,鉴定出番茄的10个TGA转录因子,其中Class Ⅱ TGAs中TGA2、TG2.2、TGA2.3基因沉默抑制CHT处理诱导的解毒基因表达和酶活性的提高以及谷胱甘肽含量的增加,进而导致CHT残留升高。TGA2基因过表达增强了植株对CHT的代谢降解能力。TGA2基因沉默导致解毒基因GST3的转录受到抑制,而过表达TGA2基因使GST3的基因表达显著提高。凝胶电泳迁移实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀实验(ChIP-qPCR)结果表明,TGA2蛋白能够与GST3基因启动子结合,促进基因的转录表达。GST3基因沉默抑制了植株的解毒代谢,导致CHT残留量显著增加。2.BR诱导的质外体H2O2激活谷氧还蛋白GRXS13和GRXS25编码基因,促进两者与TGA2转录因子发生蛋白互作并共同参与CHT残留代谢降解。外源BR处理能够通过激活解毒代谢基因表达降低番茄植株CHT残留。TGA2基因沉默抑制了外源BR对植株CHT残留代谢降解的促进作用。通过比较呼吸爆发氧化酶同系物编码基因RBOH1沉默植株与对照植株,发现CC-type谷氧还蛋白基因GRXS13和GRXS25受BR和CHT诱导,但是其表达依赖于RBOH1介导的质外体H2O2。GRXS13和GRXS25基因沉默抑制BR诱导的CHT残留代谢降解。酵母双杂交及双分子荧光互补实验证明,GRXS13和GRXS25与TGA2存在蛋白水平的相互作用,揭示了 TGA2转录因子在BR诱导的质外体H2O2信号下游受到GRX介导的谷胱甘肽化修饰的可能。3.BR和CHT能够诱导植株S-亚硝基硫醇(SNO)累积,S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)作为一氧化氮(NO)供体促进TGA2蛋白S-亚硝基化修饰,进而增强其转录活性、解毒代谢基因表达和农残代谢降解。BR和CHT通过诱导硝酸还原酶编码基因NR转录水平表达,增加叶片SNO含量。亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)能够通过抑制GSNO的积累,降低SNO的水平。沉默GSNOR基因提高了 GSTs的转录水平和酶活性,降低了植株中CHT的残留。体外实验表明,GSNO能够诱导TGA2蛋白发生S-亚硝基化修饰,这种修饰增强了 TGA2蛋白对解毒基因GST3启动子的结合能力。以上结果说明,番茄对CHT解毒代谢过程中,TGA2蛋白的S-亚硝基化修饰对其转录活性及解毒代谢功能有重要的调控作用。