心脏瓣膜疾病是一种严重危害人类健康的多发病、常见病,瓣膜置换术是治疗终末期瓣膜疾病最有效的手段,然而心瓣膜疾病的治疗在不少方面都受到较大的限制,如自体来源组织的缺乏、再换瓣手术的风险等。目前临床上使用的机械瓣、生物瓣和同种异体瓣都不是理想的的心脏瓣膜替代物,其远期治疗效果仍不令人满意。机械瓣需要终生抗凝治疗,同时发生感染的几率也比较高；生物瓣虽然具有较好的血流动力能力,不需要抗凝治疗,不容易发生感染等优点,但是容易发生瓣膜钙化、衰退和再狭窄,耐久性差是其主要缺陷；同种异体瓣则存在取材来源受限制和体内排异反应导致瓣膜衰败钙化等问题。同时,由于上述这些瓣膜均无生长性不能随着个体发育而发育,儿童病患面临着换瓣后瓣膜的再狭窄及再次手术等难以解决的问题。　　 在组织工程的研究和应用中,种子细胞的来源、功能、均一性、规模化扩增、分化能力等是制约组织工程发展的重要问题之一。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,MSC)具有高度自我复制能力、增殖能力和多向分化潜能、可植入性和重建能力等特征。同时,使用自体来源的MSC可以避免免疫排斥、伦理道德等问题,因而,MSC是组织工程瓣膜间质细胞的理想来源。为避免MSC多向分化带来的副作用,需要在体外将MSC定向诱导分化成为瓣膜细胞成分。改进瓣膜力学性能是目前组织工程瓣膜研究领域的重要方向。研究表明体外动力培养环境有利于瓣膜种子细胞stress fiber、肌动蛋白等的表达,增加细胞对机械压力的抵抗。然而,流体动力学对细胞的剥脱作用也是无法避免的,因而能否在静止条件下模拟某种培养微环境或促进某种基因的表达从而达到生物反应器条件种植的优点同时又能克服其缺点是我们目前面临的难点。　　 人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14),做为TNF受体超家族成员分布于血管内皮细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞,它的细胞质尾部可与四种不同的TRAF家族成员连接,启动下游的信号转导通路,影响调控肌动蛋白的表达,细胞黏附/迁移/增殖和分化。Fn14的表达具有组织特异性,并且受个体发育阶段的影响,有研究发现Fn14可分布在间质祖细胞和心脏。此外,做为一种细胞表面的小蛋白分子,Fn14影响调控细胞与细胞外间质蛋白的相互作用。　　 瓣膜力学强度的提高与组织结构,特别是VIC细胞黏附分子、骨架蛋白、ECM的分泌以及它们之间的紧密沟通有着密切联系。本课题首先对正常瓣叶问质细胞的骨架蛋白.机械敏感蛋白(SMA、actinin及stress fiber)的表达及空间分布定位进行分析,以此作为阳性对照指标,构建Fn14表达载体并通过基因调控的方法,探讨Fn14在MSC向瓣叶间质细胞分化中所起的作用并探讨其机制,从而探索组织工程瓣膜的构建。本研究分为四部分:　　 第一部分正常心脏瓣叶间质细胞表型分析　　 目的:瓣膜间质细胞是瓣膜的主要细胞成分,可分泌生成ECM。心脏瓣膜处于高剪切应力和高弯曲应力环境,瓣膜的耐用性主要决定于瓣膜ECM,其质量和数量又由瓣膜间质细胞决定,瓣膜力学强度的维系与瓣膜间质细胞,特别是VIC细胞骨架蛋白以及它们之间的紧密沟通有着密切的关系。本部分实验目的是对正常心脏瓣膜间质细胞表型进行分析,检测细胞骨架蛋白的表达。　　 方法:心脏瓣膜组织分别取至人正常主动脉瓣(广东省人民医院心外科提供,46岁,男性,排除心脏瓣膜疾病病史)和正常SD(200-400g)大鼠主动脉瓣,剪除周围的脂肪组织和心肌组织,取出瓣叶,经PBS洗涤,中性甲醛固定,石蜡切片。用免疫荧光染色方法检测瓣叶间质细胞是否表达SMA、stress fiber和actinin,以及它们在组织中的定位。　　 结论:在瓣叶组织中,表达SMA的间质细胞共表达stress fiber和actinin。　　 第二部分构建Fn14逆转录病毒载体及稳定细胞株的筛选　　 目的:Fn14在心脏组织的表达随心脏组织的发育呈阶段性特异表达,且对间质细胞的分化有着重要作用。具有高度自我复制能力和多向分化潜能的骨髓MSC是组织工程瓣膜种子细胞的理想来源。为避免MSC多向分化带来的副作用,需要在体外将MSC定向诱导分化成为瓣膜细胞成分。本研究联合应用基因修饰和微环境共培养方法对构建组织工程瓣膜种子细胞进行了初步探索,为进一步研究Fn14对MSC向瓣叶间质细胞诱导分化的影响奠定基础。　　 方法:采用全骨髓分离培养方法培养人来源MSC,使用半透膜间隔共培养方法将MSC与H9C2(心脏成纤维细胞株)细胞株共培养,定期每周更换新鲜的成纤维细胞,隔日换一次培养液。共培养2周。同时按照标准DNA重组操作,从人肝癌组织(广东省人民医院病理科提供)抽取总RNA,RT-PCR扩增出Fn14基因全长cDNA,经测序正确后,核酸内切酶EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ酶切PCR产物,亚克隆入pcDNA/pEGFP载体,重组质粒pcDNA-Fn14(pEGFP-Fn14)经酶切及测序鉴定正确。将空载体pcDNA(pEGFP)和pcDNA-Fn14(pEGFP-Fn14)分别转染COS7细胞和iMSC(半透膜间隔共培养微环境诱导生成的MSC,induced MSC,iMSC),筛选稳定表达Fn14的细胞系iMSC Fn14。分别通过RT-PCR和Western Blotting检测Fn14mRNA和蛋白在iMSCFn14细胞的表达水平。　　 结论:稳定表达Fn14的细胞系iMSC Fn14构建成功,为进一步研究Fn14对瓣膜VIC种子细胞分化的影响奠定基础。　　 第三部分Fn14对iMSC向瓣叶间质细胞分化的影响　　 目的:人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(Fn14)可表达于间质祖细胞,且对肌动蛋白的分布表达有着重要作用。为了进一步研究Fn14对间质细胞分化的影响,本研究将pcDNA-Fn14转染干细胞,成功构建稳定表达Fn14的细胞株,观察其对iMSC向瓣叶间质细胞诱导分化的作用。　　 方法:体外培养MSC、iMSC、iMSCmock和iMSC Fn14细胞株,WesternBlotting检测Fn14对细胞骨架蛋白(SMA、actinin)表达的影响,免疫荧光染色方法分析Fn14对机械压力敏感蛋白(SMA、actinin和stress fiber)的空间分布、蛋白排列组装以及分泌ECM的影响。为了研究Fn14对iMSC向瓣叶间质细胞分化的作用,以正常瓣膜组织的瓣叶间质细胞骨架蛋白的空间分布和定位做为阳性对照。　　 结论:Fn14有利于瓣叶间质细胞的分化,促进肌动蛋白的聚合以及ECM分泌。　　 第四部分Fn14对瓣叶间质细胞分化的信号通路研究　　 目的:Fn14在间质细胞的分化中起着重要作用,为了探讨分化过程中涉及的信号通路,本研究利用几种信号通路抑制剂,观察对肌动蛋白表达及分布排列的影响,确定PI3K-Akt信号通路是否参与调控细胞分化。　　 方法:体外培养的iMSCFn14细胞,使用不同浓度的抑制剂PD98059(ERK通路抑制剂,20,40,60μM)、SB203580(P38-MAPK通路抑制剂,5,10,20pM)和LY294002(PI3K通路抑制剂,5,10,20μM)分别刺激24h,免疫荧光染色检测各种抑制剂对SMA蛋白表达的影响。为了进一步验证PI3K-Akt信号通路的影响,Western blotting检测四种细胞(MSC、iMSC、iMSCmock和iMSCFn14)的磷酸化Akt(p-Akt)表达水平,同时还检测给予抑制剂LY294002刺激后(0h,0.4h,0.5h,1h,3h,6h,12h及24h),iMSCFn14细胞Akt蛋白磷酸化水平的变化情况。　　 结论:PI3K-Akt信号通路参与了调控间质细胞分化。　　 全文小结　　 1.首次在正常瓣膜组织的VIC细胞检测细胞骨架肌动蛋白的表达,发现人和大鼠主动脉瓣SMA阳性的VIC细胞共表达actinin和stress fiber。　　 2.在微环境诱导培养的基础上,首次构建了稳定表达Fn14蛋白的iMSCFn14细胞,观察MSC骨架蛋白的表达和分布以及Fn14对骨架蛋白的调控影响。结果发现Fn14不仅明显促进细胞SMA蛋白、actinin蛋白和stress fiber蛋白的表达,还促进这三种蛋白的聚合,由弥散状分布演变成高度有序的丝状分布,并且共定位于细胞胞浆。提示Fn14通过影响细胞骨架蛋白的聚合诱导干细胞向VIC种子细胞分化。　　 3.研究了不同信号通路抑制剂对iMSCFn14细胞骨架蛋白的影响,发现仅PI3K-Akt抑制剂LY294002可使SMA表达水平明显下降,而其他抑制剂不能有效抑制SMA的表达。提示Fn14可能通过PI3K-Akt激活从而诱导间质细胞的分化。　　 上述研究结果提示,Fn14是一个有效诱导干细胞向瓣膜间充质干细胞分化的调控因子,PI3K-Akt信号通路参与了分化调控过程。因此,针对“Fn14-PI3K-Akt”调节通路进一步探索MSC作为心脏瓣膜组织工程的潜在靶点具有重要的理论意义与应用前景。