紫杉醇(Taxol)是从红豆杉树皮中分离出新的抗肿瘤的活性物质,对临床恶性肿瘤疗效突出,明显高于普通的抗癌药物。但由于天然药源红豆杉树皮中紫杉醇含量很低(仅占树皮含量的0.01-0.02%),用天然提取的方法远远不能满足市场的需要；其他途径(细胞培养,生物合成,微生物发酵)生产紫杉醇又存在着种种弊端。近年来,随着紫杉醇生物合成前体途径相关酶基因的克隆,基因工程成为提高紫杉醇含量的有效途径之一。南方红豆杉(Taxus chinensis)紫杉醇(Taxol)合成的上游途径最主要的是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径。为了研究紫杉醇前体生物合成的分子生物学机理,和为紫杉醇前体的代谢工程提供靶点,本研究采用RACE技术克隆了南方红豆杉紫杉醇合成MEP途径上两个关键酶基因：2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(MCT),2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(MCS),并进行了详尽的生物信息学分析和功能研究。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase, MCT)是MEP途径上的第三个酶。催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)和CDP缩合成4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇(4-(cytidine 5-diphospho)-2-C-methylerythritol, CDP-ME)。本研究采用RACE技术,首次从南方红豆杉中克隆获得了MCT基因的全长cDNA,并命名为TcMCT,并对该基因进行了详细的生物学信息分析。该基因cDNA全长1293bp,包括942bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码313个氨基酸残基蛋白质,其理论分子量为34.33kDa,等电点为8.22。蛋白质序列比对分析显示,TcMCT蛋白与其它物种的MCT蛋白具有同源性,尤其与植物来源的MCT高度同源,与银杏(Ginkgo biloba)的MCT相似性达到了59.3%。预测TcMCT蛋白质三级结构由11个β-片层和5个a-螺旋组成,与拟南芥AtMCT蛋白很相似。将TcMCT与来源于植物、细菌的MCTs构建分子进化树,结果表明MCTs在进化树上按照各自所属类群分为2大枝：细菌和植物,TcMCT聚到植物的一枝,且与银杏MCT亲缘关系最接近。RT-PCR技术对TcMCT进行组织表达谱分析结果表明TcMCT在皮的表达量最高。原核表达MCT重组蛋白,Ni- NTA柱亲和层析获得约35KD的MCT重组蛋白。用圆二色谱仪对TcMCT进行二级结构测定,该重组蛋白中含有的螺旋,β-折叠,转角和无规则卷曲的比例分别为70.9%,0%,0%和29.1%。重组蛋白TcMC能够催化MEP和CDP生成CDP-ME,具有2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶的活性。颜色互补试验表明TcMCT基因的表达可以加速大肠杆菌细胞β-胡萝卜素的合成。对TcMCT基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解TcMCT在紫杉醇生物合成中的作用。2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶是MEP途径上的第五个重要酶,催化CDP-MEP生成ME-cPP。本研究采用RACE技术从南方红豆杉中克隆了MCS基因全长cDNA,将其命名为TcMCS,并且对该基因进行了详尽的生物信息学分析和功能研究。克隆所得的南方红豆杉MCS基因cDNA全长1081 bp,包括744 bp的开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸残基的MCS蛋白,其理论分子量为26.1kD,等电点为8.97。蛋白质一级结构比对显示TcMCS蛋白与其它物种的MCS是同源的,尤其与植物来源的MCS具有高度同源性,与曼地亚红豆杉的MCS相似性达到了93.9%。亚细胞定位预测TcMCS基因定位于质体,包含57个氨基酸的质体转运肽。预测的TcMCS二级结构包含26%的α-螺旋、23%β-折叠片、7%β-转角和44%随意卷曲。TcMCS蛋白的三级结构预测发现其活性中心和其他物种MCSs是一样是由3个亚基的p-折叠片组成类p桶结构,并且活性位点残基组成也是高度保守的,这说明TcMCS和其他MCSs具有相似的生物学功能。将TcMCS与来源于植物、细菌的MCSs构建分子进化树,MCSs在进化树上按照各自所属类群分为2大枝：细菌和植物,而植物类的MCSs又分为裸子植物和被子植物两类,TcMCS聚到裸子植物一枝。功能验证试验表明,TcMCS蛋白在大肠杆菌中的表达时能够促进大肠杆菌细胞β-胡萝卜素的合成。南方红豆杉紫杉醇前体生物合成途径上的MCT, MCS基因的克隆和功能研究,为研究红豆杉紫杉醇前体合成的分子和生物化机理奠定了重要基础,为紫杉醇的代谢工程提供了更多可能的调控靶点。