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第一部分:坏死性凋亡在大鼠肺缺血再灌注损伤中的作用目的:坏死性凋亡被认为可能是各种炎症性器官损伤后的共同机制,参与多种脏器或组织缺血再灌注损伤。但目前,坏死性凋亡是否参与肺缺血再灌注损伤尚未见报道。第一部分研究主要探讨坏死性凋亡在大鼠肺缺血再灌注损伤中的作用。方法:按照随机数字表法将40只健康雄性SD大鼠分为5组:假手术组(SM组)、缺血再灌注组(IR组)、Nec-1+缺血再灌注组(NI组)、z-VAD-fmk+缺血再灌注组(ZI组)和Nec-l+z-VAD-fmk+缺血再灌注组(NZ组),每组8只大鼠。其中SM组大鼠左侧胸腔开放前lh经腹腔注射DMSO 0.05ml/kg,之后仅暴露而未夹闭左侧肺门,待60min后关闭左侧胸腔;IR组大鼠左肺缺血前1h经腹腔注射DMSO 0.05ml/kg,之后制备缺血60min再灌注3h左肺原位缺血再灌注模型,而NI组、ZI组和NZ组大鼠分别左肺缺血前1h经腹腔注射Nec-1 1mg/kg、z-VAD-fmk 3mg/kg和两者联合(均溶于0.05ml/kgDMSO),其余操作同IR组。再灌注3h后,光镜观察肺组织显微结构,透射电镜观察肺组织超微结构改变,制备肺组织单细胞悬液后应用流式细胞法检测细胞死亡方式,Western蛋白印迹法测定肺组织受体相互作用蛋白1(receptorinteracting protein 1,RIP1)和RIP3蛋白表达水平。结果:SM组大鼠肺组织显微和超微结构无明显异常,IR组大鼠肺组织结构破坏严重,表现为肺泡间隔增厚、肺间质水肿及中性粒细胞浸润,肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀,胞浆内嗜饿性板层体减少、排空增多,细胞膜完整性破坏。NI组、ZI组和NZ组大鼠肺组织显微和超微结构有不同程度改善,其中NZ组大鼠肺组织损伤最轻。与SM组比较,IR组、NI组和ZI组大鼠肺组织Annexin V+ PI-细胞和Annexin V+ PI+细胞比例增加;与IR组比较,NI组大鼠肺组织Annexin V+PI+细胞比例降低,ZI组大鼠肺组织Annexin V+PI-细胞比例降低,NZ组大鼠肺组织Annexin V+PI-和Annexin V+ PI+细胞比例降低(p<0.05);与NI组和ZI组比较,NZ组大鼠肺组织Annexin V+PI+和AnnexinV+PI-细胞比例分别降低(p<0.05)。与SM组比较,IR组、ZI组和NZ组大鼠肺组织RIP1和RIP3蛋白表达增加;与IR组比较,NI组大鼠肺组织RIP1和RIP3蛋白表达降低;与ZI组比较,NZ组大鼠肺组织RIP1和RIP3蛋白表达降低(p<0.05)。结论:坏死性凋亡参与原位缺血再灌注导致的大鼠肺组织结构损伤,Nec-1预先给药尤其联用z-VAD-fmk可显著减轻大鼠肺缺血再灌注损伤。第二部分:Nec-1预先给药对大鼠肺缺血再灌注炎症反应和 p38MAPK/NF-KB通路的影响目的:丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)通路的激活与脏器缺血再灌注损伤有关,其中p38 MAPK/核转录因子-κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)通路参与炎症反应。第一部分研究证实,Nec-1预先给药可抑制坏死性凋亡,减轻缺血再灌注肺损伤,但Nel-1预先给药对肺缺血再灌注损伤中炎症反应的影响及p38 MAPK/NF-κB通路的作用未见报道。方法:按照随机数字表法将32只健康雄性SD大鼠分为4组:假手术组(SM组)、缺血再灌注组(IR组)、Nec-1+缺血再灌注组(NI组)和p38 MAPK抑制剂SB203580+缺血再灌注组(SI组),每组8只大鼠。其中,SM组大鼠左侧胸腔开放前1h经腹腔注射DMSO 0.05ml/kg,之后仅暴露而未夹闭左侧肺门,待60min后关闭左侧胸腔,3h后留取组织和血液标本待测;IR组大鼠左肺缺血前1h经腹腔注射DMSO 0.05ml/kg,之后制备缺血60min再灌注3h左肺原位缺血再灌注模型;NI组和SI则分别在大鼠左肺缺血前1h经腹腔注射Nec-1 1mg/kg和p38 MAPK特异性抑制剂SB203580 10mg/kg(均溶于0.05ml/kgDMSO),其余操作同IR组。再灌注3h后,检测肺组织磷酸化p38 MAPK、总p38 MAPK和NF-κB蛋白表达情况,测定肺组织匀浆高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 β,IL-1 β)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)浓度,计算肺组织湿干重比(wet/dry weight ratio,W/D)值,并行腹主动脉血气分析,测定动脉血氧分压(arterial partial pressure of oxygen,PaO2)和动脉血二氧化碳分压(arterial partial pressure of carbon dioxide,PaCO2)数值。结果:与SM组比较,再灌注3h后IR组、NI组和SI组大鼠肺组织磷酸化p38 MAPK和NF-κB蛋白表达增加;与IR组比较,NI组和SI组大鼠肺组织磷酸化p38 MAPK和NF-κB蛋白表达降低(p<0.05)。与SM组比较,再灌注3h后IR组、NI组和SI组大鼠肺组织匀浆HMGB1、TNF-α、IL-1β和IL-6增加;与IR组比较,NI组和SI组大鼠肺组织匀浆HMGB1、TNF-α、IL-1β和IL-6降低(p<0.05)。与SM组比较,再灌注3h后IR组、NI组和SI组大鼠肺组织W/D值增加;与IR组比较,NI组和SI组大鼠肺组织W/D值降低(p<0.05)。与SM组比较,再灌注3h后IR组、NI组和SI组大鼠PaO2降低;与IR组比较,NI组和SI组大鼠PaO2增加(p<0.05)。NI组和SI组间上述指标差异无统计学差异(p>0.05)。结论:Nec-1预先给药可能通过调控p38 MAPK/NF-κB通路抑制大鼠肺缺血再灌注过程中炎症介质的释放,降低肺组织含水量,改善肺组织氧合功能。