肺高压（pulmonary hypertension，PH）的显著特点就是血管重构和肺动脉血管平滑肌中Ca²⁺稳态改变。先前的研究表明规范性瞬时感受器电位通道蛋白（canonical transient receptor potential，TRPC）是钙池操纵性钙通道(store-operatedCa²⁺channels，SOCC)的分子基础，在慢性低氧PH大鼠中TRPC表达上调、钙池操纵性钙内流(store-operated Ca²⁺entry，SOCE)增加。本研究采用另一种广泛应用的野百合碱（monocrotaline，MCT）诱发的肺动脉高压（pulmonary arteryhypertension，PAH）大鼠模型，首先观察TRPC表达及SOCE变化与PAH的发生发展之间的关系，进而检测TRPC通路中相关信号分子：基质相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）、Orai、TRPC、钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）以及激活T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NAFT）的表达变化，以期研究整个信号通路在MCT致PAH大鼠发病过程中的作用；并采用环胞素A（cyclosporin A，CosA）治疗3w，观察其对MCT诱发的大鼠PAH的防治作用，并进一步证实TRPC通路的作用。第一部分野百合碱致肺动脉高压大鼠肺动脉TRPC表达增加及SOCE功能增强目的：研究TRPC/SOCE通路在MCT诱发PAH发病过程中的作用，及其病理生理学意义。方法：SD大鼠以2%MCT按60mg/kg剂量一次性腹腔注射，建立MCT诱导的慢性PAH大鼠模型，测定以下指标：①PAH模型鉴定：平均右心室内压（meanright ventricular pressure，mRVP）、平均右心室收缩压（mean right ventricularsystolic pressure，mRVSP）、右心重量指数（right ventricular mass index，RVMI）、HE染色观察肺动脉结构重建；②用real-time RT-PCR方法检测肺动脉TRPC1-7mRNA表达，以及上调的TRPC亚型mRNA表达时间曲线，用Western blot方法检测其蛋白表达；③用离体肺动脉环灌注方法测定环匹阿尼酸（cyclopiazonicacid，CPA）诱导离体肺动脉环（pulmonary arteries，PAs）收缩效应及时间曲线，内皮素-1（endothelin-1，ET-1）诱导离体PAs收缩效应及不同SOCC阻断剂的阻断作用；④CPA及ET-1诱发的大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smoothmuscle cells，PASMCs）胞浆游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)反应；⑤钆离子（gadolinium，Gd3+）和镧离子（lanthanum，La3+）对ET-1诱发的[Ca²⁺]i变化的阻断作用。结果：与正常对照组（CON组）相比：①MCT大鼠的mRVP、mRVSP和RVMI均明显增高，肺小动脉平滑肌层明显增厚，管腔减小，肺内小动脉管腔面积与其横截面积的比值明显减少，以及肺内小动脉管壁厚度与其半径的比值显著增加，提示MCT诱导大鼠产生显著PAH及右心室肥大；②在肺动脉TRPC1-7亚型中，TRPC1和TRPC4mRNA和蛋白表达明显增高；③SOCC通道激动剂CPA诱导的PAs收缩效应及PASMCs的[Ca²⁺]i也显著升高（P<0.01），提示MCT上调了SOCE功能；④TRPC1mRNA表达上调量高于TRPC4，峰值出现时间早于TRPC4，TRPC1mRNA表达时间曲线与CPA诱导PAs收缩效应时间曲线一致；提示TRPC1在SOCE中起重要作用；⑤MCT组ET-1诱发的PAs收缩效应的量效曲线明显左移，提示MCT大鼠PAs对ET-1的敏感性增强；⑥MCT大鼠中SOCE的阻断剂镧系元素Gd³⁺、La³⁺、非选择性阳离子通道阻断剂SK&F-96365和钙释放激活通道(Ca²⁺release-activated channel，CRAC)阻断剂BTP-2对10nM ET-1引起的PAs收缩效应的阻断作用显著增强，且Gd³⁺和La³⁺对10nM ET-1引起的PASMCs的[Ca²⁺]i增加的抑制作用显著高于CON组，提示SOCE在MCT大鼠PAs的ET-1高反应性中起重要作用。结论：MCT诱发的大鼠PAH，与肺动脉TRPC1/4表达增加以及其介导的SOCE增强有关，且上调的TRPC1/4/SOCE在MCT大鼠ET-1高反应性中起重要作用，TRPC1mRNA表达上调量高于TRPC4，峰值出现时间早于TRPC4，TRPC1mRNA表达时间曲线与CPA诱导PAs收缩效应时间曲线一致；支持TRPC1介导SOCE是PAH/PH发病过程中一个重要信号分子这一假说。第二部分野百合碱致肺动脉高压大鼠肺动脉TRPC通路信号分子的变化目的：通过观察MCT致PAH大鼠肺动脉TRPC通路信号分子（STIM-Orai-TRPC-CaN-NAFT）的变化，探讨整个信号通路在MCT诱发的大鼠PAH发病过程中的作用和机制。方法：采用real-time RT-PCR方法检测该信号通路中相关信号分子的mRNA表达变化，并进一步用Western blot验证相关信号分子蛋白表达变化。针对有变化的信号分子进行mRNA表达时间曲线检测，分析这些信号分子表达变化与CPA诱导PAs收缩效应和mRVP时间曲线之间的相关性。结果：①在TRPC上游信号分子（STIM和Orai）中，MCT预处理上调了STIM2、Orai1和Orai2mRNA的表达，STIM1和Orai3mRNA表达无显著变化，Westen-blot结果与real-time RT-PCR结果相一致。②在TRPC下游信号分子（CaN和NFAT）中，MCT上调了CaNBβ、NFATc3和NFATc4mRNA的表达，而CaNAα/β/γ、CaNBα和NFATc1/2表达变化无显著性差异。③表达上调的这些信号分子进行mRNA表达时间曲线检测时，发现STIM2-Orai1-TRPC1-CaNBβ-NFATc3/NFATc4在MCT注射后早期（3d）mRNA表达即出现显著增强，随后（5d）达到一个平台期，并一直维持到3w，而mRVP峰值出现在2w后，信号分子上调先于mRVP的升高，提示MCT可能通过上调STIM2-Orai1-TRPC1-CaNBβ-NFATc3/NFATc4诱发PAH，这种上调可能是PAH产生的原因。④CPA诱发的PAs收缩效应时间曲线与STIM2、Orai2以及CaNBβ表达时间曲线的存在很强的相关性；与TRPC1表达时间曲线的相关性显示其R值为0.716（P=0.071），TRPC1时间曲线分别与STIM2、Orai1、CaNBβ、NFATc4表达时间曲线有很强的相关性，CaNBβ表达时间曲线分别与mRVP、STIM2、Orai1、TRPC1、NFATc4的时间曲线与有很强的相关性。提示TRPC1-CaNBβ可能是该信号通路的中心环节。结论：MCT预处理3w可通过上调STIM2-Orai1/Orai2-TRPC1/TRPC4-CaNBβNFATc3/NFATc4等信号分子，诱发PAH及肺血管增生。对STIM1、Orai3、CaNA/CaNBα，以及NFATc1/NFATc2等信号分子没有影响。MCT预处理后，TRPC1及其相关信号分子（TRPC1-Orai1-STIM2-CaNBβ-NFATc4）上调先于mRVP升高，TRPC1-CaNBβ可能是MCT致PAH大鼠中各信号分子表达上调，SOCE功能增强，并最终引起mRVP增加的中心环节和启动因素。第三部分环胞素A治疗对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺动脉TRPC通路信号分子变化的防治作用目的：观察CosA治疗对MCT大鼠PAH的防治作用，分析肺动脉STIM-Orai-TRPC-CaN-NFAT信号通路在PAH发病过程中的作用，为药物治疗PAH寻找新靶点。方法：将正常SD大鼠以2%MCT按照60mg/kg剂量一次性腹腔注射，同时将CosA按35mg/kg剂量隔天腹腔注射，正常饲养3w，建立CosA治疗MCT致肺动脉高压大鼠模型；测定以下指标：①mRVSP、mRVP、RVMI、HE染色观察肺动脉结构重建；②CPA诱导PAs收缩效应；③ET-1诱发PAs收缩效应量效曲线；④Gd3+对ET-1诱发PAs收缩效应的阻断作用；⑤STIM-Orai-TRPC-CaN-NFAT信号通路中各信号分子mRNA和蛋白表达变化。结果：与MCT组相比，①CosA组显著降低了mRVSP、mRVP和RVMI，HE染色可见肺小动脉平滑肌层增生减弱，肺内小动脉管腔面积与其横截面积的比值明显增加，以及肺内小动脉管壁厚度与其半径的比值显著减少，提示CosA治疗3w抑制了MCT诱发的PAH、肺血管重构以及右心室肥大；②CosA治疗3w后，CPA诱发的PAs收缩效应由MCT组的74.0±17.8%减少到MCT+CosA组的29.4±13.0%；MCT+CosA组中ET-1诱发PAs收缩效应量效曲线较之MCT组明显右移，EC50由MCT组的0.95±0.38nM增加到MCT+CosA组的3.26±0.38nM；③CosA治疗抑制了TRPC1/TRPC4mRNA表达的上调，以及其上游的Orai2、下游的CaNBβ和NFATc3mRNA表达的上调，而对STIM2和NFATc4mRNA表达的上调无影响。结论：CosA治疗MCT致PAH大鼠模型3w，可抑制MCT诱发的PAH、肺血管增生以及右心室肥大，抑制MCT大鼠肺动脉中TRPC1/4表达上调所介导的SOCE增强引起肺动脉收缩张力增大，以及对ET-1的高反应性。CosA治疗可能通过抑制Orai2-TRPC1/4-CaNBβ-NFATc3等信号分子上调从而达到抑制PAH发生发展的作用。综合上述，TRPC1介导SOCE是MCT诱发大鼠PAH发病过程中一个重要信号通路。结合我们先前在慢性低氧PAH大鼠中的研究结果，本研究首次提出TRPC1-SOCE是不同类型PAH发病过程中的一个共同的信号通路。MCT预处理可能通过上调STIM2-Orai1-TRPC1-CaNBβ-NFATc3/NFATc4信号分子，介导SOCE增强，胞浆游离Ca²⁺浓度增高以及肺动脉血管收缩张力增强，并进一步诱发PAH，肺血管增生与重构，以及右心室肥大。CosA治疗可通过下调Orai2-TRPC1/TRPC4-CaNBβ-NFATc3，达到抑制PAH发生发展的作用。这些结果为药物治疗PAH提供新思路和新靶点。