黄瓜果瘤和果实无光泽性状基因的定位与功能分析

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黄瓜(Cucumis sativus L.;2n=2x=14)属于葫芦科(Cucurbitaceae)家族,是世界上非常重要蔬菜作物之一。果刺和果瘤一起构成了黄瓜果实的刺瘤性状,按果瘤性状可将黄瓜果实分为有果瘤和无果瘤两种类型,由于消费者对黄瓜有无果瘤的外观性状存在不同的喜好,因此果瘤性状影响着黄瓜的市场价值。模式作物拟南芥、水稻,以及甜瓜、西瓜和冬瓜等常见的葫芦科作物不具有果瘤性状,目前关于黄瓜果瘤性状形成的机制还不清楚。遗传分析表明,果瘤性状是单基因Tu(Tuberculate fruit gene)控制的显性性状。根据以前对Tu基因初步定位研究结果和已经公开的黄瓜基因组序列,本研究开发了332个SSR标记和20个SNP标记用于Tu基因的精细定位。使用2808株F2(S06×S52)大群体,利用图位克隆技术将Tu基因定位于第五染色体物理距离41.6kb区间内,该候选区域含有两个候选基因,分别是编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Csa016922和C2H2锌指蛋白基因Csa016861:Csa016922序列在两亲本S52(有果瘤)和S06(无果瘤)之间没有任何差异,呈现出100%序列同源性;而Csa016861基因序列在两亲本S52和S06呈现很大差异,S06共缺失4888bp片段,即S06完全缺失Csa016861,包括其启动子和CDS区。在Csa016861基因的启动子和CDS区域分别设计显性标记TY-1和TY-2,检测94个来自于世界各地的黄瓜品种,发现在38个有果瘤品种均存在Csa016861,同时56个无果瘤品种均缺失Csa016861,初步认为Csa016861是Tu的候选基因。另外,开发的两个显性标记TY-1和TY-2均可用于黄瓜果瘤性状的分子标记辅助选择育种。使用S06品种半脱壳的3082个子叶节作为外植体和构建好的过量表达载体pBI121-35S-Tu,通过农杆菌GV3101浸染法,进行黄瓜遗传转化实验。阳性转化苗果实呈现出果瘤性状表型互补的现象,验证了Csa016861就是Tu基因,控制果瘤性状。Tu基因仅含有一个外显子,CDS区编码的213个氨基酸序列中含有植物C2H2型锌指蛋白特有的高度保守的一段氨基酸序列QALGGH,因此,Tu是编码C2H2型锌指蛋白的基因。Southern杂交实验显示,Tu基因在黄瓜基因组中以单拷贝形式存在。瞬时转化烟草实验结果表明,Tu主要定位于细胞核中,符合转录因子特征。通过定量RT-PCR,半定量RT-PCR及mRNA原位杂交,发现在果瘤发育过程中,Tu基因在果瘤上面的刺部位特异性表达。在无毛无瘤突变体gl中,尽管存在Tu,但Tu基因并不能表达,说明无毛基因gl对Tu起到隐性上位的作用。这些研究结果同时也说明果刺(毛)是黄瓜果瘤形成的前提条件。本研究可以解释黄瓜果实有果瘤肯定有刺,有刺不一定有瘤,无刺肯定无瘤的现象。通过对黄瓜果实不同部位细胞分裂素(CTK)的含量比较分析,确定果瘤性状的形成与CTK高含量有关,CTK加快细胞分裂而导致细胞数目增多的结果。本研究分析了开花前2天(果瘤起始时期)S06转基因植株果实刺瘤部位和S06果实表皮的基因表达谱,发现Tu基因很可能调控CTK通路(No. ko00908)上的两个上游CTK-羟化酶基因Csa5M644580和Csa5M224130,因此Tu基因很可能调控CTK的合成。另外,甜瓜的Tu同源基因(No: MELO3C005347)在甜瓜果实中不能表达,导致无瘤甜瓜的形成,为Tu基因能够调控黄瓜果瘤性状提供了更多的证据。本研究还分析了Tu基因的进化特点,发现黄瓜Tu基因很可能是拟南芥ZFP6的直系同源基因。最后,本研究提出了黄瓜果实刺瘤性状形成的遗传网络机制。果实光泽性状也是黄瓜非常重要的外观性状之一,影响着黄瓜的市场价值。通过对光泽性状的多个群体的遗传分析表明,黄瓜无光泽性状为单基因D (dull fruit skin gene)控制的显性性状。本研究通过检测第五染色体的66个已经发表的分子标记,发现有46个分子标记在定位亲本S94(无光泽)和S06(有光泽)间呈现多态性。进一步通过群体分离法分析法(BSA),发现11个标记与D/d基因紧密连锁。使用216株F2(S06×S94)分离群体,将D/d基因初步定位于SCZ69标记和SSR16203标记之间,遗传距离分别为0.3cM和0.6cM,这两个标记之间物理距离为422.8kb。根据这422.8kb候选序列,总共开发了155个SSR标记,其中8个SSR标记在S94和S06间呈现出多态性。使用842株F2(S06×S94)分离大群体,将标记获得的分离数据与田间性状数据整合,构建了D/d基因的精细定位图谱,D/d被定位于新开发的SSR标记SSR37和SSR112之间,物理距离为244.9kb,该区间含有31个候选基因。通过半定量RT-PCR分析,确定D候选基因为Csa016880、Csa016887或Csa016899。与D/d位点紧密连锁的2个共显性标记SSR37和SSR112,对72个黄瓜品种进行检测,结果表明SSR37和SSR112这两个标记均可用于黄瓜果实光泽性状的分子标记辅助选择育种。本研究为D/d的最终克隆奠定了良好的基础。
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