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为探讨鸡传染性支气管炎(IB)重组新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗株rLaSota二联活疫苗的可行性和长片段外源基因的插入对病毒拯救的影响,本研究应用公开发表的鸡传染性支气管炎病毒Massachusetts 41株S基因序列设计引物,利用RT-PCR技术,以IBV M41 RNA为模板,扩增得到IBV S基因片段(3 500 bp),将其插入到NDV弱毒疫苗株rLaSota载体中。在辅助质粒的共同作用下,通过共转染BSR细胞拯救出含有S基因的重组新城疫病毒rL-IBVS。进一步以S片段为模板,设计S1引物,通过PCR扩增得到S1基因片段(1 700 bp),采用上述方法拯救出重组病毒rL-IBVS1;同时以新城疫弱毒疫苗rLaSota突变型载体rL-FmF为载体构建并拯救出表达S1基因的突变型重组病毒rL-FmF-S1。对3种不同重组病毒的遗传稳定性、外源蛋白的表达、生物学特性及不同重组病毒对SPF鸡诱导机体产生特异性抗体能力等方面进行了研究。采用RT-PCR检测接种重组病毒的尿囊液,结果表明重组病毒中含有相应外源基因。IFA试验表明,救获的重组病毒可与鸡抗IBV的高免血清发生特异性反应,证明外源蛋白在感染的BSR细胞中得到表达。通过鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)等致病性指标对重组病毒毒力进行评估,试验结果:rL-IBVS、rL-IBVS1的MDT值分别为133.3 h和127.2 h,ICPI、IVPI均为0,表明rL-IBVS和rL-IBVS1保持了亲本疫苗株rLaSota高滴度的鸡胚生长特性和低致病力特性,rL-FmF-S1的ICPI为0.52,略高于前两者,但其IVPI未出现变化,对鸡胚致死能力仍保持了rLaSota缓发型特点(MDT≥90 h),表明外源基因的插入可不同程度地致弱病毒。对重组病毒免疫原性进行评价,SPF鸡免疫试验结果表明三种重组病毒均可有效的刺激机体产生特异性抗体。本研究应用反向遗传操作技术构建了表达IBV重组NDV病毒,并对其生物学活性、致病性、免疫原性等进行了研究,为进一步研制IBV和NDV的重组基因工程活载体疫苗奠定了基础。