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miRNA393是植物中一个保守的microRNA家族,其功能研究主要包括植物免疫反应、生长发育和胁迫反应三个方面。迄今,miR393/靶基因表达在种子萌发中的调控机制和生物学功能尚无报道。水稻是重要的禾本科作物,具有能在水淹条件下种子萌发和生长的独特生长习性。其中空结构的胚芽鞘通过不断伸长至氧气充足的水面,以获得种子萌发所需的氧气,为水稻提供了一个水淹环境下的生存机制。我们前期实验发现水稻miR393的靶基因是生长素受体基因OsTIR1和OsAFB2,且miR393a在胚芽鞘中强表达,在此基础上,我们将进行miR393a/靶基因在水淹条件下种子萌发中的表达与功能研究。本文以水稻为研究材料,构建了一系列miR393及其靶基因表达的转基因株系,希望通过对其转录位点、表型及调控机制的研究,探索miR393a/OsTIR1在水稻种子萌发时胚芽鞘和胚根生长中的作用。获得主要实验结果如下：一、在转录活性上的特征(1)OsTIR1与OsAFB2的转录活性部位不同。OSTIR1转录活性主要在主根、不定根和冠根的根尖,以及幼嫩的颖壳、叶舌和节中。而OsAFB2则主要在幼嫩的颖壳、叶节及节的部位。(2)在种子萌发初期,MIR393a和OsTIR1的转录在不同组织(盾片,胚根,胚芽鞘,侧根)呈现重叠、互补、相邻的三种空间对应特点。(3)水稻胚芽鞘气孔由一对肾形的保卫细胞构成,不同于叶片气孔中典型的哑铃型保卫细胞。启动子分析发现MIR393a在气孔形成早期的拟分生组织(merisstemoid)中强烈转录,暗示miR393可能参与了气孔发育的调控。指示生长素反应的DR5启动子元件在气孔发育的整个过程中都有转录活性,在成熟的气孔保卫细胞中最强。二、对水稻萌发阶段生长发育及相关基因的影响(1)miR393表达促进水稻萌发初期胚根的生长,并抑制侧根的生长。显微观察发现,MIR393过表达株系的胚根伸长区的长度增长,细胞数目增多,而MIM393株系伸长区变短,细胞数减少。(2)过量表达miR393抑制胚芽鞘和胚芽鞘顶端气孔的生长,并使胚芽鞘中的细胞壁松弛因子(Expansin)基因EXPA4,EXPA7和ExPB12基因的转录水平下降。(3)经气相色谱-质谱联用(GC-MS)法对游离生长素含量的测定结果显示,miR393促进胚芽鞘中游离生长素的积累。同时qRT-PCR结果显示过表达miR393可以提高胚芽鞘中生长素合成关键基因OSYUCCA1和OsYUCCA4的转录水平。三、在水淹条件和ABA处理中的调控机制(1)水淹(submergence)减弱了MIR393a在胚芽鞘尖端和其上气孔中的转录活性,并增强了其中的DR5反应。(2)ABA处理抑制胚芽鞘生长,增强了MIR393a在胚芽鞘尖端和气孔中的转录活性,并减弱了其中的DR5反应。ABA对水稻胚芽鞘生长的抑制作用,很可能与EXPA2和EXPA4有关。(3)Northern blot结果显示,OsTIR1可以正向反馈调节miR393的积累水平。综上所述,本研究发现MIR393a在胚根基部、侧根原基、胚芽鞘尖端和即将形成气孔的拟分生组织中具有强转录活性,通过调控生长素信号途径影响主根、侧根、胚芽鞘的生长和气孔的发育,并且影响胚芽鞘内源生长素的积累水平。此外,MIR393a的转录水平受水淹胁迫的抑制和植物激素ABA处理的诱导,还受到靶基因OsTIRl的正向反馈调节作用。我们的研究揭示了MIR393a及其靶基因在水稻种子萌发初期的调控作用。