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目的:比对分析得到绵羊基因组MHC区段DRA的基因序列及其exon2的序列;构建酿酒酵母表面展示重组载体pYD1-DRA;对感染布鲁氏菌及正常的绵羊个体的DRA基因exon2进行DNA池化扩增,同时分析其多态性,获得多态位点;对OLA-DRA基因exon2两端进行快速定点基因突变,突变为特定酶切位点;构建DRA基因酿酒酵母表面展示库;检测OLA-DRA基因是否稳定表达展示在酿酒酵母细胞表面,探索初步筛选与绵羊DRA蛋白相结合的布鲁氏菌抗原肽的可行途径。为绵羊抗病选育以及进一步研究MHC的抗病机理奠定基础,并提供一定的参考依据和理论支持,从而加快分子遗传抗病育种的进程。方法:1、将牛和绵羊MHCⅡDRA基因mRNA序列利用BLAST比对得到它们的基因序列和外显子序列,继而用GenBank中的SNP数据库查寻牛和绵羊的SNP位点。利用DNAMAN6.0软件分析牛MHCⅡDRA外显子的SNP位点,得到牛MHCⅡDRA有丰富多态性的外显子序列,通过DNAStar SeqMan软件比对分析获得与这些外显子相似性较高的绵羊MHCⅡDRA基因exon2序列。2、本试验利用布鲁氏菌虎红平板凝集诊断试剂盒和试管凝集试验对240只绵羊血液样本进行布鲁氏菌阳性血清检测,然后利用PCR结合SSCP技术对MHCⅡDRA基因exon2的SNP位点进行检测,采用DNA池PCR产物直接测序法对600例布鲁氏菌阳性和阴性个体OLA-DRA基因exon2的SNPs再次进行检测,并对含有SNP位点的exon2进行克隆测序,运用分子生物学软件进行比对分析多态位点。3、通过基因定点突变方法插入特定限制性酶切位点,构建OLA-DRA基因酵母表面展示库,进行蛋白诱导表达及细胞免疫荧光试验,利用荧光显微镜检测OLA-DRA蛋白是否展示在酵母细胞表面。结果:1、通过生物信息学分析及基因克隆测序,得到与牛同源性高的绵羊MHCⅡDRA的基因序列,并于NCBI发布,GenBank登录号为KR422362,并分析比对得到其具有多态性的exon2的序列。2、利用布鲁氏菌虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测羊种布鲁氏菌感染的阴阳性,在240只绵羊中共检测发现阴性个体174只,阳性个体66只,并对阳性个体进行复检,最终布鲁氏菌阳性检出率为27.5%。3、利用PCR结合SSCP技术的方法对这240只绵羊MHCⅡDRA基因exon2进行检测,发现绵羊DRA基因exon2具有多态性,exon2序列第143bp发生了碱基突变,由G变为A,氨基酸由Arg变为His。4、通过基因定点突变法成功插入特定限制性酶切位点,并成功构建出OLA-DRA基因酵母表面展示库,经蛋白诱导表达及细胞免疫荧光试验,于荧光显微镜下显现绿色荧光,DRA蛋白成功展示于酵母细胞表面。结论:1、通过PCR-SSCP方法对绵羊OLA-DRA基因的exon2进行多态性分析,并对PCR产物进行直接测序,发现exon2具有多态性。2、分析OLA-DRA基因的多态位点,对其exon2全长246bp进行测序序列对比分析,获得3个多态位点,exon2第46位碱基C/G、第120位碱基G/A和第143位碱基G/A具有多态性,这与免疫基因编码产物的多样性相一致。3、本研究构建OLA-DRA基因酵母表面展示库,经诱导表达及细胞免疫荧光后,在荧光显微镜下激发出绿色荧光,表明OLA-DRA基因表达蛋白成功展示在酵母细胞表面。