自组装纳米簇模拟过氧化物酶:光谱学及电化学研究

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模拟酶是人工合成或经过人工修饰的用来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程的超分子结构。与天然酶相比,模拟酶结构简单、效率高、选择性好、化学性质稳定、反应条件范围广、价廉易得等优点。因此,模拟酶技术无论是在生物学、分析化学等研究领域中还是将来在工业实际应用中都具有重大意义。本实验采用高分子带电材料Nafion(NF)和天然马心细胞色素C(Cyt c)构建新型自组装纳米簇过氧化物模拟酶(artificial peroxidase,AP)结构,采用电子透射技术、圆二色谱法、紫外可见光等光谱学方法及直接电化学方法,研究模拟酶的结构、生物化学特性、光谱学酶促动力学参数测量以及模拟酶直接电化学特性、机制、电化学酶促动力学参数测量等。实验选用浓度为0.1μmmol/L的Cyt c为模拟酶的“活性中心”,5%的NF溶液为模拟酶外部的“二级结构”,当二者混合于Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中,自组装形成直径大概为40nm左右的链球状纳米簇模拟酶结构。利用紫外分光光度计以H2O2为酶底物,愈创木酚(Guaiacol)为氢供体,测量模拟酶光谱学特性及酶促动力学参数。从实验数据分析得出:当模拟酶在pH10.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中时,酶活性最高,但在pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中时模拟酶酶活性稳定性最高,所以本实验选用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液为测试溶液。模拟酶与高浓度底物H2O2共存情况下,模拟酶在碱性环境中抵抗底物自杀性失活能力最弱,但酶反应速度最快,在酸性环境中,模拟酶结构稳定性高,对高浓度H2O2抵抗能力强。分析外界因素对模拟酶酶活性的影响,实验选用氨基酸、阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)及离子浓度对模拟酶酶活性影响的测试。当在模拟酶酶溶液中加入三种氨基酸-组氨酸、赖氨酸、色氨酸(L-His、L-Lys、L-Cys)后,三种氨基酸对模拟酶酶活性均具有影响,在不同酸度条件下,影响各不相同;在模拟酶溶液中加入SDS后,模拟酶酶活性随SDS浓度的增加而逐渐降低;在不同pH条件下,随着缓冲液离子浓度的增加对模拟酶酶活性影响各不相同。该模拟酶不仅具有很好的稳定性,而且对过氧化氢(H2O2)底物也有很好的响应和高催化效率,利用紫外分光光度计测量模拟酶酶促动力学米氏常数Km为2.5μmmol/L,催化速率Kcat为0.069s-1,相对催化速率为0.028μM-1s-1,与天然辣根过氧化物酶(HRP)相比,其催化效率为HRP的40%左右。利用电化学方法实现了模拟酶的直接电化学测试,成功将NF-Cyt c模拟酶与纳米复合材料纳米金(AuNPs)/L-半胱氨酸(L-Cys)/羧基化碳纳米管(MWCNTs-COOH-COOH)膜连接并修饰于玻碳电极表面,制备第三代酶生物传感器,运用电化学循环伏安法分析模拟酶电化学反应机制为固化机制,并且电子迁移速度常数Ks为0.65s-1。模拟酶生物传感器对底物H2O2具有很好的响应,当模拟酶催化浓度为0.02至10nmol/L的H2O2,其阴极峰电流随H2O2浓度增加而增大,并且得出模拟酶催化H2O2检测下限值为0.05nmol/L,电化学表征米氏常数Kmapp为2.3×10-10mol/L。由实验数据我们得出以下结论:1、成功设计自组装纳米簇模拟过氧化物酶;2、该模拟酶对H2O2底物具有很好的响应和高催化效率;3、Cyt c-NF模拟酶可代替天然过氧化物酶构建第三代生物传感器。
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