重组绵羊朊蛋白(OvPrP<'C>)的构象转化与Prion疾病发生机制的研究

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenziling
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传染性海绵状脑病是由于正常细胞膜蛋白——朊蛋白(prionprotein,PrPC),发生构象改变后形成致病型朊蛋白(也称“痒病相关朊蛋白”,PrPSc),PrPSc聚集并在脑组织沉积,引起人和多种动物的一类慢性神经退行性疾病。而PrPC转化为PrPSc,相应结构域由α-螺旋变为β-折叠结构,构象转化引起的发病机理至今尚不完全明确。本研究采用蛋白质化学和结构生物学的方法,对重组绵羊朊蛋白的结构进行了体外转化调节,获得了β折叠含量较高的且对蛋白酶K有抗性的朊蛋白。为今后进一步探明朊蛋白的发病机理奠定了基础,研究内容如下: 利用DNA重组技术,构建原核表达系统,应用IPTG诱导,并利用WesternBlot方法进行了鉴定。结果表明:在37℃、OD为0.8时经IPTG(0.8mmol/L)诱导表达5h条件下,重组PrPC蛋白的表达量最高。经Westernblot方法检测,表达蛋白与特异性单抗AH6反应良好。表达的蛋白以包涵体形式存在,采用8M尿素结合缓冲液溶解,经Ni-NTA亲和层析法纯化重组绵羊朊蛋白OvPrP23~256。采用稀释复性和透析复性相结合的方法,可以获得复性率较高的体外重组朊蛋白,以便于重组绵羊朊蛋白的结构学研究。 为探明酸性pH和铜离子对重组绵羊朊蛋白结构转变的影响,我们对重组绵羊朊蛋白进行体外调节。CD检测结果显示,随着pH降低,OvPrP23~256的结构中,β折叠增加,α螺旋减少,并且对蛋白酶K具有部分抗性。CuCl2对绵羊的重组朊蛋白在体外进行氧化还原调节,CD检测结果,揭示朊蛋白结构中的α螺旋减少,β折叠增加,并且结合铜离子后的朊蛋白对蛋白酶K产生抗性。采用酸性pH和铜离子交互作用后,结果表明,在pH5.5左右时,加入同样的CuCl2会使得蛋白结构中β折叠明显增加,而在极低pH下,结构中的β折叠减少,α螺旋增加,铜离子抑制了在酸性pH下蛋白结构中β折叠的增加。我们的研究揭示了铜离子能够调节酸性条件下的朊蛋白的结构转变,为构象转变的过程提供新的科学依据。 为揭示RNA对朊蛋白的结构转变的影响,不同比例的RNA与朊蛋白在体外进行结合反应,CD图谱显示,在RNA与蛋白比为0~0.033时,波峰在215~218nm处,呈现典型的β折叠曲线。然而RNA与蛋白比值增加至0.5时,在208nm和222nm处朊蛋白结构呈现出典型的双峰,与未加RNA时的结构曲线相吻合。这表明了RNA的作用有生理性阈值,超过阈值,导致RNA作用不明显。 采用CuCl2和RNA交互作用于OvPrP23~256时,核酸蛋白复合物的形成,引起了绵羊的重组朊蛋白结构变化。CD检测图谱显示了在215nm处出现吸收峰,揭示了α螺旋减少,β折叠增加。经过蛋白酶K抗性检测,发现其具备了蛋白酶K抗性。二者同时作用时,产生协同作用,促进了重组绵羊朊蛋白OvPrP23~256的结构转化,并且改变了朊蛋白的生物学功能,揭示了其可能与朊蛋白疾病的发生有关。
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