肌生成抑制素是一种骨骼肌生长的负调控因子。是出Se-JinLee等（1997）在研究转化生长因子-β（TGF-β）超家族时，用该家族的蛋白质同源保守序列设计简并性引物，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增而得到的一种新的生长因子，最初被命名为生长分化因子8（GDF-8）。用基因打靶敲除GDF-8基因，制备了基因缺失小鼠，发现无GDF-8的小鼠明显比野生型小鼠大，骨骼肌呈现大而广范围的增长，小鼠骨骼肌的重量是普通小鼠的2-3倍以上，而脂肪并未随之增加，这些结果说明GDF-8是骨骼肌生长的负调控因子。因此，根据其功能将其定名为肌生成抑制素（Myostatin，MSTN）。 Ravi kambadur对牛MSTN cDNA进行了克隆，分析了双肌症牛的基因序列，发现Belgian Blue牛在编码区外显子3发生11bp的缺失，导致MSTN分子的活性区域消失，使MSTN活性丧失，结果肌肉大量增加。Piedmontese牛在外显子1中保守的Phe残基（第94位氨基酸）被Leu残基取代；外显子3的蛋白质成熟区第314位氨基酸残基Cys残基变为Tyr残基，而导致MSTN活性丧失。在定向破坏MSTN基因的小鼠，也表现出双肌的表型，这是肌纤维肥大和增生的结果。 一些研究人员研究了MSTN在体内各组织器官内的表达情况，除在骨骼肌~1中表达外，还可以在心肌~1、乳腺、脂肪组织等中 中国人民解放军军需大学博士研究生学位论文 中文摘要表达。在其他组织器官中的表达，未见报道。在妊娠的早期，肌生成抑制素开始在某些肌肉中表达，在随后的时期，在大量的发育中的骨骼肌中检测到GDF、8的表达。在成年动物，GDF－8仍继续表达。通过Northern分析，在所检查的不同成年动物的骨骼肌中，可以见到GDFS的特异性表达。尽管在脂肪组织中的信号很弱，但仍清晰可辩。 探索抑制肌生成抑制素活性而增加肌肉量的方法，在农业和医疗应用上有潜在的价值。但MSTN基因在原核载体中的表达，国内外尚未见报道。MSTN基因原核表达载体的构建，可通过基因工程的方法大量制备MSTN，可促进对MSTh分子生物学的研究，并为其生产应用打下基础。为此，我们用RT－PCR的方法检测了 MSTN InRNA在军牧一号猪体内的表达情况，以掌握 MSTN在各组织器官内的表达。并利用RT－PCR成功地反转录到猪MSTN成熟蛋白的编码序列，并克隆到pMD18丁载体和 pET28a （＋）表达载体中，并对其表达进行了初步的研究。 在实验一中，我们使用TrZ。l法，从军牧一号新品种猪的骨骼肌、心肌、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、胰脏和脂肪组织中提取总RNA，用RT－PCR和嵌套PCR的方法，检测了MSTN mRNA在上述各组织器官内的表达，结果表明，在骨骼肌、心肌和脂肪组织中检测到MSTN mRNA的表达，其中在骨骼肌中的表达较强。所获结果与文献报道的结果相同。 在实验二中，我们从猪肌生成抑制素（MSry）编码序列中设计引物（OYHS00，OYHS005和OmS004卜以军牧一号猪肌细胞MSTN mRNA为模板，利用RT－PCR和嵌套PCR技术，扩增 中国人民解放军军需大学博士研究生学位论文 中文摘要出 MSm CDNA片段，该片段全长 1277 hp，包含猪 MSw基因的全部编码序列。将所得片段与 pMD1载体连接，转化到JM 09大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂法提取质粒，通过PCR和酶切分析，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道结果的同源性为99．5％，只有4个核昔酸发生改变，但所编码的氨基酸只有1个发生改变，这说明猪MSTN的编码序列是高度保守的，这对稳定猪的遗传性状具有十分重要的意义。 由于在原核表达系统中，缺乏翻译后加工过程，在翻译时信号肽不能被去除。这样，在实验三中，我们从猪肌生成抑制素 （MS州）编码序列中重新设计引物（OYHS029和 OYHS004卜去除其信号肋的编码序列，以己构建的 MSTN CDNA克隆质粒pMD1－MSTh为模板，扩增 MSTh成熟蛋白编码序列。PCR扩增结果，获得了1225加的特异性片段，与设计大小一致。将所得片段与 pMD＊载体连接，转化到 JM 09大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆。经 EcoR和 Hnd Ill酶解分析，挑选目的DNA片段在 pMD 18＊载体中为下向插入的克隆，提取质粒，用Ban。HI禾 Sail酶切，回收 1．Zkb白 目白片段，定向 克隆到 pET28a ＋）中，转化JM109受体陶，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到 BLZI（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，成功地构建了猪肌牛成抑制素原核表达绒体。用 RT－PCR和 Northern印迹法，均检测到＊＊TN＊＊NA们大d。将该二＿程菌接种于5叫含卡那霉素（＊＊N叩叫。，37℃Ww八作过夜，次日将此菌液按1：10的比例抢刊·丁250；。。11、1｝液休川芥基中，三7℃振荡培养，当细菌长至适川川丹l0、］，UI入IPTG 终浓度为 lmM）诱导，继续培养约3h， 中国人民解放军军需大学博士研究生学位论文 中文摘要离心收集菌体，用PBS洗涤菌体，重悬于适量的PBS中，加等体积的电泳上样液，煮沸 10min，进行 SDS－P