牙龈卟啉单胞菌对人巨噬细胞系U937凋亡的影响

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目的:  建立牙龈卟啉单胞菌W83感染人巨噬细胞系U937模型,应用透射电镜、Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术三种方法检测不同浓度牙龈卟啉单胞菌感染巨噬细胞后对其凋亡的影响。  材料与方法:  一、研究对象  牙龈卟啉单胞菌W83菌株及人巨噬细胞系U937  二、实验方法  1、培养牙龈卟啉单胞菌W83及人巨噬细胞系U937。  2、以不同浓度W83感染U937。实验分为空白对照组、感染复数100∶1组、感染复数200∶1组和感染复数500∶1组;感染时间为24小时和48小时。  3、透射电镜观察,记录空白对照组正常巨噬细胞电镜图及实验组不同状态下巨噬细胞透射电镜图。  4、用AnnexinⅤ进行荧光素(FITC)标记,以标记了的AnnexinⅤ作为荧光探针,应用流式细胞仪记录U937凋亡百分率。  5、以荧光染料Hoechst33342为标记物,用荧光显微镜记录感染模型上述时间点和浓度下U937的凋亡情况。  三、统计学分析  应用SPSS17.0统计软件进行统计分析,实验数据采用重复测量数据的方差分析,P<0.05认为存在显著性差异。  结果:  1、成功建立牙龈卟啉单胞菌感染巨噬细胞模型。  2、透射电镜观察到空白对照组正常巨噬细胞细胞膜清晰连续,细胞核膜完整,有丰富的细胞器存在。实验组随着感染复数的增加,细胞出现了不同凋亡时期的形态。凋亡早期细胞体积缩小,细胞膜皱缩,细胞核膜浓缩;凋亡中期观察到了靠近细胞核膜的类似“新月”的环状形态。  3、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测结果显示:空白对照组细胞凋亡百分率远远小于实验组。同一感染复数下48小时组细胞凋亡率高于24小时组,且当感染复数达到500∶1时,凋亡率达到各自组的最高值。无论感染时间为24小时或48小时,随着感染复数的增高,细胞凋亡率都呈逐渐上升趋势。  4、Hoechst33342染色结果显示随着感染复数和感染时间的增加,被染成高蓝色的凋亡细胞逐渐增多。  结论:  透射电镜、Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡结果均显示牙龈卟啉单胞菌能够有效的诱导人巨噬细胞U937发生凋亡,并且在一定范围内呈现浓度性和时间依赖性。
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