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ROPGEFs(鸟嘌呤核苷酸交换因子)是Guanine Nucleotide Exchange Factors的简称,它是小G蛋白Rac/ROP的上游活化因子,催化小G蛋白由GDP结合态转化为GTP结合态。Rac/ROP是一种分子开关,它可以调节植物多种生长发育以及参与多种信号途径,其中包括调节花粉管的生长、根毛的发育、过氧化氢的产生以及参与生长素、脱落酸等植物激素的信号转导途径。Rac/ROPGEFs是近年来被鉴定的一个新的基因家族,在拟南芥基因组中有14个成员。此家族成员的序列当中都含有一个保守的结构域,被称为PRONE(plant-specific Rop nucleotide exchanger)结构域,此结构域对GEF活化Rac/ROP具有重要作用。目前关于ROPGEFs的生物学功能的研究比较少,因此通过对ROPGEFs的生物学功能进行研究有助于我们深入了解Rac/ROP介导的信号转导机理。
本论文当中采用了反向遗传学的方法对拟南芥Rac/ROPGEF1基因的功能进行了研究,我们构建了GEFI::GUS载体、GEF1基因过量表达的载体和RNA干涉载体,将以上载体通过农杆菌的介导转入拟南芥野生型植株当中,经过筛选最终得到了转基因植株。我们对转基因植株的研究结果主要如下:
1.GEF1的时空表达模式分析
我们首先通过GUS组织化学染色法分析GEF1基因的时空表达模式,发现GEF1启动子的活性在胚胎发育阶段呈动态变化,在球形胚阶段,GEF1不对称表达,在胚柄细胞表达明显比胚体区域强;在心形胚时期,GEF1在胚体包括根极表达水平较高;在成熟胚阶段,GEF1在茎尖和根尖生长点的表达明显增强。在胚后发育中,GEF1基因在幼苗的茎尖、根尖以及花分生组织中活性较高,以及在根的维管组织和侧根中表达。GEF1基因的表达模式暗示着该基因可能在植物的胚胎发育和胚后发育的器官发生中具有重要的调控作用。
2.GEF1过表达植株的表型分析
在GEF1基因过量表达的幼苗当中,幼苗的子叶形状发生改变,成为钻石形状,而野生型对照的子叶为圆形,在显微镜下进一步观察发现过表达植株幼苗子叶表皮细胞的裂片形成减少,细胞间失去镶嵌生长特点。此外,过表达植株幼苗的根毛发育也发生异常,根毛明显比野生型对照宽,在顶端发生分枝,与野生型对照管状根毛结构相比,失去了顶端极性生长的特性。
上述结果表明,过表达GEF1基因影响叶片表皮细胞和根毛细胞正常发育,导致细胞极性的丧失。
3.GEFlRNAi植株的表型分析
在10天的GEFl RNA干涉的幼苗中,我们观察发现GEF1基因表达下调的植株侧根数目比野生型对照减少,这个观察结果暗示GEF1基因可能参与调控侧根的发育。