脂肪肝是哺乳动物常见的营养代谢病,严重影响了哺乳动物的机体健康,对某些哺乳类家畜、宠物、特种经济动物而言,由于高能量日粮摄入过多或机体自身代谢问题也会导致脂肪肝的发生,影响动物机体健康。因此探究脂肪肝的发病机制从而发掘治疗脂肪肝的靶点,对相关畜种养殖业的健康发展具有重要意义。本试验以大鼠、小鼠肝细胞、奶牛为研究对象,探究早期脂肪肝对肝脏脂质代谢和机体免疫的影响,以期为易患脂肪肝的哺乳类家畜、宠物、特种经济动物脂肪肝的相关研究提供一定的数据支持。1.大鼠早期脂肪肝模型的确立与表型分析24只8周龄Sprague-Dawley大鼠,随机分为两组,FL（脂肪肝）组饲喂高脂且胆碱缺乏日粮进行早期脂肪肝模型诱导,CON组饲喂普通日粮,试验期为44天。确定模型诱导成功以后对两组大鼠血清生化指标,激素指标等进行测定。结果显示,FL组与CON组相比,NEFA（游离脂肪酸,P=0.0015）、TG（甘油三酯,P=0.0413）、LDL（低密度脂蛋白,P=0.0029）、ALP（碱性磷酸酶,P=0.0059）、TP（总蛋白,P=0.0001）、胰岛素（P=0.0123）和胰高血糖素（P=0.0259）浓度显著升高,生长激素（P=0.0119）、钙离子（P=0.0138）和IGF-1（胰岛素样生长因子-1,P=0.0222）水平显著降低。而GLU（葡萄糖）、HDL（高密度脂蛋白）、ALB（血清白蛋白）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）、ALT（丙氨酸氨基转移酶）、镁离子、磷离子和LDH（乳酸脱氢酶）在FL组和CON组之间无显著差异（P＞0.05）。FL组HOMA-IR（胰岛素抵抗指数）显著增加（P=0.0235）。试验期结束时,FL组的大鼠体增重显著高于CON组（P=0.0305）,但是对于肝脏、肾脏、脾脏、心脏相对于体重的器官指数并没有显著变化（P＞0.05）。2.大鼠早期脂肪肝对肝脏脂质代谢的影响通过对两组大鼠的肝脏进行广靶脂质组学分析发现,在肝脏组织中共检测到了脂质代谢物982种,其中474种在两组之间存在显著差异。42.51%GP（甘油磷脂类）有显著差异,而这些差异中97.78%的脂质是显著下调的。65.60%的GL（甘油脂类）和29.52%的SL（鞘脂类）发生了显著变化,而二者中分别有94.72%和96.77%的差异表达脂质是上调的。KEGG富集分析发现,7条通路是显著富集的（P＜0.05）,分别是:胆固醇代谢、维生素消化和吸收、脂肪消化和吸收、脂肪细胞脂解调节、IR、产热和甘油脂类代谢。通过对两组大鼠的肝脏进行转录组学分析,发现只有少部分的基因发生显著变化,两组之间差异表达基因共178个,其中DNL（脂质从头合成）过程相关基因表达受到抑制,Cyp（细胞色素P450）家族基因的表达受到显著影响。KEGG富集分析发现8条通路在两组中显著富集（P＜0.05）:类固醇激素生物合成、脂肪消化吸收、化学致癌、视黄醇代谢、胆汁分泌、细胞色素P450对外来物质的代谢、PPAR（过氧化物酶体增殖物激活受体）信号通路和胆固醇代谢。脂质组学和转录组学联合分析发现,早期脂肪肝肝脏最显著的特征是脂质吸收、胆固醇代谢及代谢途径的改变。3.早期脂肪肝对大鼠多器官炎症反应的影响在患有早期脂肪肝大鼠的肝脏中发现已呈现出向脂肪肝炎发展的趋势:相关基因Cxcl13、Nfatc4、Slit2、apoa4在两组之间出现显著差异,炎症反应相关的PPAR通路显著富集（P＜0.05）。而在IR发生期间,容易引发肝脏在内的全身非感染性慢性炎症。所以本研究测定了血清、脾脏、肾脏、十二指肠中Ig A（免疫球蛋白A）、Ig G（免疫球蛋白G）、Ig M（免疫球蛋白M）、IL-1β（白细胞介素-1β）、IL-2（白细胞介素-2）、IL-6（白细胞介素-6）、IL-10（白细胞介素-10）、TNF-α（肿瘤坏死因子α）的浓度,以探究肝脏以外重要组织器官的炎症发生情况。本研究发现在这些组织器官中都有不同程度的炎症反应。因为脾脏是机体最大的免疫器官,所以对脾脏进行了转录组学分析,以探究早期脂肪肝对脾脏的影响。脾脏中筛选出差异表达基因共78个,KEGG富集分析发现2条通路显著富集（P＜0.05）:PPAR信号通路、卟啉代谢通路,GO分析发现血红素生物合成功能和有机酸转运等受到影响。4.早期脂肪肝对大鼠肝脏脂自噬的影响对两组大鼠的肝脏做了冷冻切片,对其进行免疫荧光试验,检测自噬相关蛋白LC3B（微管组织蛋白1轻链3b）和脂滴（LD）膜蛋白ADRP（脂肪细胞分化相关蛋白）的共定位情况,同时对自噬相关蛋白P62、LC3B和ADRP使用Western Blotting的方法进行检测,发现大鼠早期脂肪肝肝脏脂自噬增加。5.PKLR基因对脂肪肝的调控机制研究本研究试图找到一个调节脂肪肝发生的关键基因,试验选择PKLR基因作为目标基因进行了一系列试验,以验证该基因对脂肪肝的调控作用。培养基中添加油酸钠0.25m M处理12h,对NCTC-1469细胞诱导早期脂肪肝模型,使用si RNA-PKLR对PKLR基因进行抑制,p CMV6-PKLR对PKLR基因进行过表达,发现过表达PKLR基因能够增加细胞中LD的面积,而抑制PKLR基因以后油酸钠诱导相同时间,LD的面积明显减小。当PKLR基因表达受到抑制以后,造脂基因Acacb、Elovl6、FASN、SCD的表达量显著下调（P＜0.05）,而过表达PKLR基因以后,这些基因的表达呈现出不同程度的上调（P＜0.05）。最后,通过对泌乳初期奶牛进行体况评分挑选疑似患有脂肪肝的奶牛和正常奶牛,晨饲前采集尾根静脉血液,收集血清测定血清中β羟基丁酸和NEFA含量,血清指标进行初步筛选后,对12头奶牛（5头正常奶牛,7头疑似脂肪肝奶牛）进行肝脏活体穿刺采样,再进行油红O染色对奶牛脂肪肝发生情况进行准确鉴定。随机挑选3头正常奶牛,3头患有脂肪肝奶牛的肝脏进行后续试验,对挑选出的6头奶牛的肝脏提取RNA,对造脂基因及PKLR基因的表达量进行检测。试验结果发现患有脂肪肝的奶牛与正常奶牛相比肝脏中造脂基因Acacb、Elovl6、FASN、SCD以及PKLR基因的表达量是显著上调的（P＜0.05）。综上所述,高脂日粮诱导的早期脂肪肝能够对大鼠体增重产生显著影响,但是对各器官的器官指数影响较小,对血清生化指标和血清激素水平影响较大。脂肪肝发生早期,肝脏少量基因表达发生变化便能引起脂质的剧烈变化。早期脂肪肝肝脏最显著的特征是脂质吸收、胆固醇代谢及代谢途径这三条通路的改变。脂肪肝的发生不仅影响肝脏,更能引起全身性炎症反应,早期脂肪肝对于脾脏的影响主要是影响血红素的合成和免疫功能的改变,并且伴随着脾脏脂质转运和代谢的改变。脂肪肝发生初期,肝脏能够针对激增的脂质作出自我调节性反应,包括抑制DNL和促进脂自噬。PKLR基因能够对脂肪肝起到调控作用,可能的原因是通过影响脂质的合成。