研究目的自从1985年Miller在非洲爪蟾中发现了最早的锌指蛋白TFIIIA中存在能与锌离子结合的四面体保守结构后,科学家们陆续发现了大量锌指结构蛋白。一般锌指蛋白中结合锌离子的氨基酸残基是Cys或His,根据与锌离子结合的氨基酸不同,可分为C2H2,C4,C6,C4HC3,C3H,C2HC或其他联合组合的形式,其中又以C2H2种类居多。大部分具有锌指结构的蛋白质能参与众多的生命活动。比如能与特定的DNA或者蛋白质结合介导基因的转录调控功能,参与细胞的增殖,分化,凋亡等,异常调控与肿瘤的发生发展密切相关。CXXC5的研究大部分集中在血液病研究中,其中主要集中在急性髓系白血病中,阻碍CXXC5的作用使得急性髓系白血病有良好的预后。关于CXXC5在实体瘤中的研究处于起始阶段,相关报道称,在外周神经瘤细胞中,KANK1通过调节CXXC5并诱导细胞凋亡从而能有效抑制恶性的外周神经瘤的进展,在另一方面CXXC5可以与组蛋白甲基化酶SUV39H1相互作用从而介导CD40基因启动子上H3K9和H3K27的甲基化修饰从而抑制T细胞上的CD40的表达。CXXC5是进化上高度保守的锌指结构蛋白,其在乳腺癌中的生物学功能尚需进一步研究。乳腺癌已经是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占女性新发肿瘤的25%,死亡率占女性肿瘤的15%,乳腺癌严重威胁着广大女性的健康和生命,严重影响了家庭、社会和经济的发展。上皮间质转化(EMT)是肿瘤转移过程中的重要环节之一。所以研究EMT的分子机制及CXXC5在肿瘤的浸润和转移过程中所发挥的作用具有重要的意义。研究方法通过在线上数据库KM-plotter分析得知CXXC5的表达量与乳腺癌患者的生存率具有负相关关系。接着通过免疫亲和纯化和蛋白质谱鉴定发现与CXXC5相互作用的蛋白。体内体外免疫共沉淀实验都验证质谱结果。将SIRT1进行分段克隆探讨与CXXC5相互作用的分子机制。利用免疫荧光共定位系统确定CXXC5与SRIT1的细胞亚定位。在乳腺癌细胞系中进行Transwell细胞侵袭实验,并通过western blotting和RT-PCR荧光实时定量实验证实CXXC5对EMT转化中标志物的影响。具体步骤如下:第一,通过NCBI中查阅CXXC5的cDNA序列,设计引物并构建Flag-CXXC5质粒,并在KM-plotter数据库中分析其表达量与乳腺癌患者生存率的相关性。第二,通过在乳腺癌细胞系中过表达Flag-CXXC5质粒然后进行亲和纯化和质谱测序鉴定,得到体内与其相互作用蛋白,并用相对应的抗体对质谱结果进行免疫共沉淀验证。第三,通过免疫荧光共定位探讨CXXC5的细胞亚定位,确定发挥功能的位置。第四,通过western blotting和qPCR的实验方法来探讨沉默CXXC5后对EMT转化的影响。第五,通过Transwell小室探讨CXXC5在乳腺癌中对细胞侵袭力的影响。研究结果本实验通过构建人源CXXC5的真核表达质粒载体系统,并利用生物信息学分析KM-plotter线上数据库得出CXXC5的表达量与乳腺癌患者生存率具有负相关关系。通过银染蛋白质谱分析鉴定出能与CXXC5体内体外相互作用蛋白SIRT1和CRL4B复合物,进一步研究发现CXXC5能促进EMT和促进乳腺癌细胞侵袭的能力。文章首先鉴定出CXXC5相互作用蛋白,并且证实其具有一定促进EMT的作用,与乳腺癌的生存曲线负性相关,有利于我们更加深入的认识CXXC5的功能和发挥作用的分子机制。