论文部分内容阅读
研究背景艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）又称获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）引起的传染性疾病。自从20世纪80年代首次报告艾滋病临床病例以来,艾滋病在世界迅速蔓延,目前在全球已呈爆发性流行趋势,对人口平均寿命和世界经济发展产生了巨大的影响,成为21世纪人类面临的最重大公共健康问题。艾滋病已经成为人类前所未有的最具毁灭性的疾病。至今,发达国家已投入了大量的资金及人力资源,对HIV本身以及抗HIV的药物进行研究。目前被批准用于临床的治疗AIDS的药物主要分为核苷类逆转录酶抑制剂（nucleocide reversetranscriptase inhibitors,NRTI）、非核苷类逆转录酶抑制剂（Non-Nucleoside ReverseTranscriptase Inhibitors,NNRTI）、蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor,PI）、整合酶抑制剂和进入抑制剂5大类,这些药物主要是通过和底物竞争结合酶或结合到酶上使之变性,抑制酶的活性,从而破坏HIV的生活周期,达到抑制病毒复制的目的。这些药物可以在一定程度上延缓病人病情的恶化,但并不能彻底清除患者体内的病毒。大部分病人一直生活在病毒低水平复制的状态中,长期用药患者将产生抗药性,并且一旦停止用药,病人体内病毒水平很快又恢复到甚至超过用药前的水平。在HIV感染过程中,首先是HIV包被膜与靶细胞的细胞膜发生融合。HIV与靶细胞融合主要由包膜糖蛋白gp160（由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共价结合而成）介导。gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体（趋化因子受体CCR5或CXCR4等）依次结合,导致gp41的构型发生改变,形成6股α-螺旋束核心结构,将病毒包膜与靶细胞膜拉近并发生融合,完成病毒进入宿主细胞的感染过程。因此,抑制融合过程中的任何一个环节,就能抑制HIV进入靶细胞,从而预防和治疗HIV的感染。gp120、gp41、CD4、趋化因子受体（CXCR4或CCR5等）均可作为HIV进入抑制剂的药物作用靶点。由于化学药物在临床治疗中疗效不甚理想,而且副作用较大,于是我国医药工作者从祖国中医药宝库中寻求中医中药对艾滋病的治疗,从而推动世界各国从植物中筛查预防与治疗艾滋病的药物研究。在对中草药有效成分的分析研究中发现,一些中草药的多糖、皂苷、生物碱、黄酮以及蛋白质类物质可以抑制HIV复制,具有很好的抗HIV病毒活性。黄酮类（flavonoids）是一大类天然存在的具有抗病毒活性的化合物,研究发现其显示出对HIV良好的抑制活性。皂苷（saponin）是天然产物中一类重要的化学成分。皂苷具有多种多样且相当重要的药理活性和生物活性,如抗肿瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖和免疫调节等,从而显示出广阔的应用前景。挥发油也称精油（volatile oil）,是存在于植物体中的一类具有挥发性、可随水蒸气蒸馏出来的油状液体的总称。挥发油在植物界分布极广,作为中药使用的植物就有数百种含有挥发油,尤其在菊科、芸香科、伞形科、姜科等科属中较为常见。挥发油具有抗肿瘤、抗菌、抗过敏和抗病毒作用,并具有一定的酶抑制活性。本实验主要研究从番石榴叶中提取的三种成分皂苷、黄酮及挥发油抑制HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束形成的作用。目的从番石榴叶中提取出皂苷、黄酮及挥发油,研究三种提取物对HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束的抑制作用,为寻求新的抗HIV病毒进入抑制剂提供实验依据。方法1.实验用HeLa细胞传代按1×105个/ml的密度用10%完全培养基接种于96孔培养板中,每孔种植100μl。继续培养24h后,细胞随机（随机方法参照文献[21]）分组:对照组（control）及其他不同剂量组（皂苷、黄酮分为1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml、0.03 125 mg/ml;挥发油分为50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml）,每组设4孔。用RPMI-1640基础培养基配制不同浓度药物,每孔加入100μl,干预24h后,MTT法测OD值,求出其半数细胞毒性浓度(median toxic concentration,TC50)。2.予TC50以下的不同浓度的皂苷、黄酮及挥发油,用夹心酶联免疫测定法（ELISA）检测番石榴叶提取物对HIV包膜蛋白亚基gp41六股螺旋束结构形成的抑制作用。N36和C34是从HIV gp41的NHR和CRH区衍生出来的多肽,二者在体外能形成类似gp41 NHR和CRH结合的螺旋结构。因此,抗gp41六螺旋束核心结构的活性可以用抑制N36和C34结合的作用来测定。3.统计方法:运用SPSS13.0统计软件进行统计,所有数据均以均数±标准差（（?）±S）表示。各组MTT比色法结果比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA）。组间均数两两比较,若方差齐性,用LSD（Least Significant Difference）法;若方差不齐性,用Dunnett’s T3方法。P＜0.05表示有显著差异。结果1.MTT法测得各个不同样品浓度作用后的细胞存活率,药物的半数细胞毒性浓度(TC50)用PHARM/PCS-VERSION4软件计算得出:番石榴叶的三种提取物皂苷、黄酮、挥发油的半数细胞毒性浓度(TC50)分别为137.6μg/ml,71.62μg/ml,23.63μg/ml。皂苷、黄酮在最大浓度（1mg/ml）时细胞存活率分别为17.28%、14.53%,在最低浓度（0.03125mg/ml）时细胞存活率分别为93.32%、85.64%。挥发油在最大浓度（50μg/ml）和最低浓度（0.1μg/ml）时细胞存活率分别为25.39%、82.21%。2.应用基于抗原抗体反应的夹心ELISA法对皂苷、黄酮及挥发油三种化合物进行了筛选,在终浓度为25μg/ml时皂苷与黄酮对HIV gp41六螺旋束结构形成有明显抑制作用,二者的抑制率都大于50%,而挥发油在终浓度为25μg/ml时的抑制率较低,低于50%,而且皂苷和黄酮组的抑制率显著高于挥发油组。挥发油组、皂苷组与黄酮组三组均数间都有显著差异（P＜0.0001）。组间两两比较显示,挥发油组与皂苷组、黄酮组比较均有显著差异（P＜0.001）,皂苷组与黄酮组相比无显著性差异（P=0.507）。故在初步筛选后弃掉挥发油,皂苷和黄酮进一步做梯度稀释计算半数抑制浓度(IC50)。皂苷、黄酮稀释为25μg/ml、15μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml五个浓度梯度,二者均在25μg/ml的时候抑制大部分gp41六螺旋束结构的形成,皂苷在2.5μg/ml时以及黄酮在1μg/ml时能够抑制部分六螺旋束结构的形成。二者相比较,黄酮的抑制作用比皂苷稍强。通过计算得皂苷和黄酮的半数抑制浓度(IC50)分别为5.65μg/ml、0.87μg/ml。这说明了皂苷和黄酮类化合物能够作用于HIV gp41抑制其形成六螺旋束核心结构,可能也在抑制HIV与靶细胞融合中发挥作用。结论通过对提取的皂苷、黄酮类化合物及挥发油的筛选,发现皂苷及黄酮具有良好的抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的作用。本研究为从中草药等天然产物来源寻找HIV进入抑制剂提供了借鉴和思路。