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研究背景和目的:
肝纤维化是肝损伤后的修复反应,主要特征为肝星状细胞(hepaticstellate cells,HSCs)活化及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积。早期肝纤维化是可以逆转的,因此对肝纤维化早期始动机制的研究具有重要意义。活化蛋白-1(active protein-1,AP-1)是一种与组织纤维化密切相关的转录调控因子,它可以在转录水平调节胶原基因的表达;还可以调控转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta,TGF-β1)、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor metal proteinase,TIMP-1)等促纤维化细胞因子的表达。可见AP-1是一种与ECM合成、降解密切相关的转录因子。然而目前对AP-1在肝脏纤维化中的表达研究尚少,对于AP-1在肝脏纤维化进程中介导细胞外基质表达的分子机制亦不十分清楚。
血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)是已知最强的HSCs有丝分裂剂。PDGF通过与其受体(PDGF receptors,PDGFR)结合启动下游蛋白的级联磷酸化反应来发挥生物学效应。近年来对PDGF/PDGFR的信号转导途径有许多新的发现。有研究表明,在人肾小球系膜细胞,PDGF-BB可以通过MAPK/AP-1信号途径来诱导靶基因表达;在SD大鼠的血管平滑肌细胞,PDGF-BB可以诱导AP-1的DNA结合活性。但目前对PDGF-BB信号通路在肝纤维化体内实验中与MAPK/AP-1信号通路的关系尚无明确报道。
本研究采用CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,观察:1)中药肝复康对肝纤维化大鼠肝功能和肝组织形态学的影响;2)肝复康对AP-1在肝纤维化大鼠肝组织中表达的影响;3)PDGF-BB/PDGFRβ和MAPK/AP-1信号通路在大鼠肝纤维化模型中的关系及肝复康对二者表达的影响。
方法:
SD大鼠,随机分为正常对照组、12周模型组(12w)、20周模型组(20w)、肝复康高、中、低剂量治疗组和预防组。除正常对照组,其余组大鼠皮下注射以橄榄油稀释的10％的CCl4(0.5 mg·kg-1),每周2次,共12周;正常对照组注射同体积CCl4溶媒。肝复康预防组从CCl4注射第1周开始,给予肝复康(312.5 mg·kg-1·d-1,po);第12周末,将12w模型组和肝复康预防组处死。肝复康高、中、低剂量组从CCl4注射第9周开始,分别给予肝复康高、中、低剂量(3125、312.5和31.25mg·kg-1·d-1,po);第20周末,将20w模型组和肝复康高、中、低剂量治疗组处死。采集大鼠血及肝组织。赖氏法测血清ALT和AST活性;溴甲酚绿比色法测白蛋白;考马斯亮蓝比色法测球蛋白。HE染色观察肝组织形态结构变化。双盲法采用Ishak评分系统对肝脏纤维化程度进行组织学评估。
免疫组织化学法观察c-Fos、c-Jun、PDGF-BB、PDGFRβ和α-SMA蛋白在肝组织的表达;逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)法测定c-fos、c-jun、PDGF-BB、PDGFRβ、TIMP-1和α1(Ⅰ)型前胶原基因的表达水平;电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)测定AP-1的DNA结合活性;免疫蛋白印记(Western blot)检测p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-p38MAPK、α-SMA和Ⅰ型胶原在肝组织的表达;实验结果以均数±标准差((x)±s)表示,采用SPSS统计软件。组间比较采用方差齐性检验,作单因素方差分析。p＜0.05表示差异有显著性。
本研究结果如下:
1.肝复康对肝纤维化大鼠肝功能和肝组织形态学的影响
HE染色肝组织病理切片结果显示,与正常组相比,12w和20w肝纤维化模型组肝组织结构破坏:假小叶形成、纤维间隔不规则增厚、肝细胞脂肪变性和大量炎症细胞浸润;肝复康预防组,炎症细胞浸润、肝细胞脂肪变性和纤维化得到显著改善;肝复康高、中、低剂量治疗组的肝纤维化均有不同程度改善,中剂量组(312.5mg/kg/d)效果最明显。
与正常组相比,12w和20w肝纤维化模型组的血清ALT和AST活性均显著上调,而白蛋白,球蛋白比(A/G)均下降;其中12w模型组ALT和AST活性上调最为明显(p＜0.01)。与12w模型组相比,肝复康预防组血清ALT和AST活性显著下调,A/G上调;与20w模型组相比,肝复康中剂量和高剂量治疗组(312.5和3125mg/kg/day)下调ALT和AST活性、上调白/球蛋白比效果明显。
2.肝复康对AP-1在肝纤维化大鼠肝组织中表达的影响
免疫组化结果显示,正常组几乎不表达c-Fos和c-Jun;12w模型组肝组织可见大量c-Fos和c-Jun核阳性表达;与12w模型组相比,肝复康预防组阳性表达显著减少,仅余少量胞浆表达。20w模型组亦可见显著核阳性表达;与20w模型组相比,肝复康治疗组阳性核表达显著减少,其中中剂量组效果最明显。
RT-PCR结果显示,c-fos和c-jun mRNA在正常对照组无表达,12w和20w肝纤维化模型组c-fos和c-jun mRNA水平显著增加(p＜0.01);与12w模型组相比,肝复康预防组二者表达下调。与20w模型组相比,肝复康治疗组二者表达均下降,其中中剂量组效果最明显,与正常对照组相比差异无显著性。
EMSA结果显示,与正常组相比,CCl4的刺激使12w模型组AP-1的DNA结合活性显著上调;与12w模型组相比,肝复康预防组AP-1活性显著下降(p＜0.01)。20w模型组AP-1的DNA结合活性亦显著升高,肝复康中剂量治疗组AP-1的DNA结合活性显著下调。
3.PDGF-BB/PDGFRβ和MAPK/AP-1信号通路在肝纤维化大鼠模型中的关系及肝复康对二者表达的影响
免疫组织化学结果显示,正常组大鼠肝组织几乎不表达PDGF-BB和PDGFRβ;20w模型组大鼠肝组织可见大量PDGF-BB和PDGFRβ胞浆阳性表达,肝复康治疗组二者阳性表达均显著减少,中剂量组效果最明显,仅余少量胞浆表达。Western blot结果显示,肝复康预防组亦可以显著缓解上调的PDGF-BB和PDGFRβ的蛋白表达。RT-PCR显示PDGF-BB和PDGFRβ的变化趋势与免疫组化和Western blot检测结果一致。
Western blot结果显示,12w和20w的模型组大鼠肝组织的p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38MAPK显著上调;肝复康预防组和治疗组的p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38MAPK表达均下调(Fig.2)。
Western blot和RT-PCR结果显示,与正常组相比,TIMP-1和Ⅰ型胶原在12w和20w肝纤维化模型组的表达均显著上调;而肝复康预防组和治疗组二者表达明显减弱。
PDOF-BB/PDGFRβ和三条MAPKs信号通路的表达趋势与TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达趋势一致。统计学相关性分析显示,各组TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达与PDGF-BB/PDGFRβ和MAPKs/AP-1信号通路的表达呈显著正相关。
结论:
1.肝复康中剂量治疗组显著改善肝功能、减轻肝损伤;肝复康预防组肝纤维化程度亦明显减轻,提示肝复康对肝损伤具有预防和缓解作用。
2.AP-1参与了大鼠肝纤维化的发生发展,肝复康可以显著抑制AP-1的活性。
3.肝复康可能通过抑制PDGF-BB/PDGFRβ和MAPKs/AP-1两条信号通路来影响肝纤维化中TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达。