透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是以尿苷二磷酸-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)两种单糖作为底物,通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接形成二糖单位,作为结构单元重复组成的糖胺聚糖。HA可广泛用于化妆品和药物中。HA的生物学功能与其分子量(MW)直接相关,大分子量透明质酸具有空间填充、抗血管生成和免疫抑制的作用;低分子量透明质酸具有独特的生物学活性,可以刺激成纤维细胞增殖和胶原合成。HA传统制备方法主要是从动物组织中提取,具有感染跨物种病毒的风险。因此,目前商业化的HA生产主要依赖于链球菌属某些减毒菌株的发酵。此过程的生产成本较低,产生的环境污染也较少。然而,链球菌种具有一定的致病性风险,加之遗传背景复杂,可用于遗传改造的基因操作工具较少,限制了这种方法的发展。因此,构建具有较高生物安全性且遗传背景清晰的HA产生菌株是很有必要的。枯草芽孢杆菌(B.subtilis),通常被认为是安全的菌株,理想的细胞工厂,前人成功的将透明质酸合酶(Hyaluronan synthase,HAS)基因转入枯草芽孢杆菌168中,并且已经进行HA的发酵生产。首先,我们在枯草芽孢杆菌中构建了CRISPR/Cas9双载体系统。其次,我们将枯草芽孢杆菌168中的合成透明质酸相关的基因克隆出来,使用克隆载体PUC119进行连接,转化进大肠杆菌中,用于后续基因相关操作。然后,我们使用重叠延伸PCR技术,分别将GlcUA操纵子、GlcNAc操纵子和tetM操纵子上的基因连接到一起,构建了三个能在大肠杆菌中大量复制的质粒,并且将三个操纵子中的表达单元转化到枯草芽孢杆菌中。最后在摇瓶培养中,我们检测了HA的产量和分子量,通过是否在培养基中添加茶碱小分子的对比,证明了在培养基中添加茶碱小分子,可以增加HA的产量,使HA的产量达到1.81 g/L;同时降低了HA的分子量,使分子量降低到1.01 MDa。证明了茶碱小分子可以调控GlcUA通路的转录。显示了GlcUA分支途径的所有基因(pgcA、gtaB和tuaD)的过表达,和HA的分子量呈负相关,和HA的产量呈正相关。GlcUA操纵子的上游包含P43启动子和茶碱核开关,P43启动子可以增强基因的表达,当向培养基中加入茶碱小分子时,茶碱结合核开关,抑制终止子结构形成,进行转录,增加了UDP-GlcUA的合成,使枯草芽孢杆菌能够高效地合成低分子量的HA。GlcNAc操纵子的上游包含P43启动子和四环素核开关,当向培养基中加入四环素小分子时,四环素结合核开关,抑制终止子结构形成,进行转录,增加UDP-GlcNAc的合成,使枯草芽孢杆菌能够高效地合成高分子量的HA。tetM操纵子的上游包含P43启动子和四环素抗性基因,使枯草芽孢杆菌在培养基中存在四环素情况下仍能正常生长。本文以合成生物学为基础,在枯草芽孢杆菌中构建了可以调控生产特定HA分子质量的代谢通路,为后续小分子调控枯草芽孢杆菌代谢通路,大量生产特定分子量大小的透明质酸提供可能。