一、研究意义肺癌是一种发病率较高的恶性肿瘤,其病死率居各种恶性肿瘤之首,其中小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)约占15%。由于小细胞肺癌细胞倍增时间短、进展快,常伴内分泌异常或类癌综合征,早期即发生血行转移,故小细胞肺癌的治疗应以全身化疗为主,联合放疗和手术为主要治疗手段。虽然小细胞肺癌细胞早期对放化疗非常敏感,但多数患者在以顺铂为基础的联合治疗过程中迅速发生多药耐药(multidrug resistance,MDR)而导致治疗失败,其临床预后较差。因此,小细胞肺癌的抗药性已成为目前临床治疗中亟待解决的问题。非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)是近年来在真核生物中发现的一类在人类基因组中约占90%的核酸序列,它们的转录本长度既有短至19-25个核苷酸的微RNAs(microRNAs,miRNAs),又有长达200-100000个核苷酸的长链非编码 RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)。非编码 RNAs 通过在转录及转录后水平调控蛋白编码基因的表达,广泛参与到细胞分化、胚胎发育、新陈代谢、免疫调控等重要生命过程,其突变和失调可以造成多种人类疾病的发生,甚至引起肿瘤发生与肿瘤耐药。有研究发现,lncRNA除了可以直接调控其近端基因的表达,那些含有miRNA效应元件的lncRNA还能够结合miRNA而降低游离的功能性的miRNA的表达,从而通过降低miRNA而间接促进了 miRNA靶基因的表达,这种“lncRNAs-miRNAs-靶基因”的调控模式称为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)调控模式。该调控模式已被越来越多的研究证实为ncRNAs参与基因表达调控的重要形式,并丰富了 RNA-RNA相互作用网络。lncRNA HOTTIP(HOXA distal transcript antisense RNA)是一种长达 4665 bp、并不参与蛋白质编码的HOX家族成员,染色体循环将其带到HOXA基因附近,通过在HOXA基因5’端起始转录来协助激活邻近HOXA基因的表达。多项研究证实,HOTTIP可以通过激活HOXA13的表达参与多种肿瘤的发生发展甚至化疗抗药性的产生。本课题组前期研究发现,HOTTIP可能通过促进HOXA11和HOXA13的表达参与小细胞肺癌化疗抗药性的产生,但其作用机制尚不清楚。本课题组前期研究中利用lncRNA及miRNA芯片技术分析小细胞肺癌多药耐药模型H69AR相对其亲本细胞(化疗敏感细胞株)H69中lncRNAs及miRNAs差异表达的情况发现,以HOTTIP为代表的多个HOXA家族成员在耐药细胞株H69AR中的表达显著高于H69细胞(两倍以上的差异),而以miR-574-5p为代表的37种miRNAs在耐药细胞株H69AR中的表达显著低于H69细胞,随后我们通过实时荧光定量 PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)技术验证了上述芯片结果。进一步的研究表明,小细胞肺癌组织和H69AR细胞中HOTTIP呈相对高表达,而miR-574-5p相对低表达,提示HOTTIP可能与小细胞肺癌化疗抗药性的产生密切相关;结合患者临床病理资料,我们分析发现HOTTIP还可以作为患者疾病分期、生存时间预测的预后指标之一。我们接下来通过生物信息学网站microRNA seq(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/lmputController?viewtype=Text&trans cripr=ENST00000421733&version=MB21E78v2&species=HomoSapiens&type=lnc.RNA)和 microRNA.org(http://www.microma.org/microrna/home.do)预测发现,miR-574-5p在HOTTIP和EZH1的启动子区均有结合位点,然后我们采用qRT-PCR和Western blot技术检测发现,miR-574-5p沉默后可以促进HOTTIP和EZH1的表达。因此,HOTTIP可能通过竞争性抑制miR-574-5p的表达参与小细胞肺癌耐药。本课题组前期在国家自然基金的资助下进行cDNA表达谱芯片检测已经发现,与 EMT 相关的主要标志物(E-cadherin,Snail,Twist,Vimentin,β-catenin)在小细胞肺癌多药耐药细胞株及其亲本细胞株中呈现差异表达,提示EMT可能与小细胞肺癌多药耐药密切相关。因此,HOTTIP是否通过介导EMT参与小细胞肺癌化疗抗药性的发生值得进一步研究。本课题组拟在前期研究基础上,采用分子生物学和细胞生物学技术,利用小细胞肺癌细胞株H69/H69AR和H446/H446DDP探讨HOTTIP参与小细胞肺癌耐药的分子机制(详见研究内容)。通过本项目的研究,将进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制,为小细胞肺癌靶基因治疗提供新的靶点,为寻找小细胞肺癌耐药及预后的生物学标志物的研究提供依据,为解决临床棘手的小细胞肺癌耐药问题提供一种新策略。二、研究目的本研究中采用lncRNA芯片、miRNA芯片等高通量筛选技术,并辅以生物信息学软件和网站预测、经典分子生物学实验技术等手段,利用临床小细胞肺癌石蜡组织、小细胞肺癌多药耐药细胞模型H69AR和体内裸鼠成瘤模型等多个层面,探讨HOTTIP作为ceRNA诱导EMT参与小细胞肺癌发生发展及耐药机制的调节。通过本项目研究,进一步丰富小细胞肺癌发生及耐药的分子机制,为筛选小细胞肺癌耐药及预后的生物学标志物提供理论依据。三、材料与方法1.非编码RNA芯片课题组利用Arraystar公司的人类lncRNA芯片技术分析小细胞肺癌多药耐药细胞株(H69AR)与化疗敏感细胞株(H69)的lncRNA差异表达谱,并结合前期通过北京博奥生物芯片有限公司的miRNA芯片差异表达谱的结果,利用生物信息学技术寻找与小细胞肺癌耐药可能相关的非编码RNA分子。2.临床样本收集2008年1月至2015年1月在南方医科大学附属顺德第一人民医院接受治疗的115例小细胞肺癌石蜡包埋组织,标本来自活检组织及纤维支气管镜检查穿刺组织,经病理诊断为小细胞肺癌。本研究经南方医科大学附属顺德第一人民医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3.细胞培养人小细胞肺癌化疗敏感细胞株NCI-H69、NCI-H446、NCI-H146和多药耐药细胞株NCI-H69AR均购自美国ATCC;另一多药耐药细胞株H446DDP细胞为本课题组根据文献报道(PMID:2436751)的NCI-H69AR细胞的建立方法构建;16HBE为人支气管上皮细胞株。4.细胞转染(1)瞬时转染:采用阳离子脂质体法,将miR-574-5p mimics(模拟物)、inhibitors(抑制物)或antagomir(拮抗剂,更稳定,可用于动物实验)及其阴性对照(miR-NC)序列,和 HOTTIP、HOXA11、HOXA13、EZH1 的小干扰 RNA 序列和pcDNA3.1/PEX-3表达载体及相应的阴性对照载体,分别转染5株小细胞肺癌细胞和1株人支气管上皮细胞,获得瞬时上下调miR-574-5p、HOTTIP、H0XA11、HOXA13、EZH1 的细胞。操作按 LipofectamineTM2000 试剂说明书进行。(2)稳定转染:①采用阳离子脂质体法,将表达HOTTIP的pcDNA3.1载体及相应的空载体、表达HOXA11、HOXA13的PEX-3载体及PEX-2空载体(绿色荧光标记)分别转染H69和H446细胞,通过G418筛选阳性转染子进行扩大培养,获得稳定高表达HOTTIP、HOXA11、HOXA13的H69和H446细胞株。操作按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。②采用慢病毒法,将HOTTIP的siRNA干扰序列通过LV3慢病毒载体包装后进行靶细胞侵染实验,同时设立LV3-NC对照转染组,获得稳定沉默HOTTIP的H146、H69AR及H446DDP细胞株。5.总RNA的提取及qRT-PCR(1)细胞内总RNA的抽提参照TRIZOL试剂说明书进行操作;石蜡包埋组织内总RNA的抽提采用Qiagen公司产品石蜡组织RNA提取试剂盒(miRNeasy FFPE Kit)说明书进行操作。(2)取上述RNA进行逆转录和qRT-PCR。逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明,PCR反应在qRT-PCR反应仪上进行。miRNA特异性的逆转录序列及内参U6参照miRNAs qRT-PCR试剂盒说明。GAPDH和U6 snRNA分别作为内参,三次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt进行分析。6.Western blot采用细胞裂解法提取细胞内全蛋白,参照石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒(上海生工,货号BSP058)说明书提取组织内全蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度,根据蛋白分子量选择配制10%～12%的分离胶然后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,采用Quantity One(Bio-Rad)软件进行蛋白相对表达强度定量。7.CCK8法分析细胞增殖情况及对化疗药物的敏感性CCK8法测增殖:在96孔板中接种细胞悬液(100 ml/孔),置于培养箱预培养(37℃,5%C02);向每孔加入10 μl的CCK-8溶液(避免生成气泡);将培养板置于培养箱内孵育1～4 h;用酶标仪测定细胞在450 nm波长处的吸光度;连续几日在固定时间进行测定;以空白孔为对照,分析各孔细胞吸光度,制作细胞生长曲线。CCK8法测药敏:按照接种密度为1×104/100 μ1将细胞平铺于96孔板中,细胞进行瞬时或稳定转染后培养24h;分别加入阿霉素(Adriamycin,ADM)、顺铂(Cisplatin,CDDP)及足叶乙甙(Etoposide,VP-16)三种药物,继续培养24 h;每孔100 pl培养基加CCK8溶液10μl,37℃、5%CO2条件下孵育细胞4 h;在酶标仪上测定各孔细胞在450 nm波长处的吸光度;求5个复孔的吸光度的平均值,计算各组细胞在每种药物各浓度梯度作用下的存活率:细胞存活率=(实验组吸光度—空白对照组吸光度)/(阴性对照组吸光度—空白对照组吸光度)×100%。以上操作步骤重复三次,求各组细胞存活率的平均值,并以细胞存活率为纵轴、药物浓度对数为横轴作半对数图,然后计算出各组细胞对每种化疗药物的IC50值。8.流式细胞术利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化,在瞬时转染24 h或者稳定转染后收集细胞,采用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒分析其凋亡率;细胞周期检测需经70%乙醇于4℃固定过夜,经PI染色后再进行测定。9.克隆形成实验平板克隆形成实验:制备单细胞悬液,分别取500个细胞接种于直径3.5 cm的培养皿中,其中加药处理组次日更换为含药培养基(根据IC50确定药物浓度)。5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养14～21 d,可见细胞集落时终止培养。常规PBS漂洗,甲醇室温固定10 min,0.4%结晶紫室温染色10 min。显微镜下记数大于50个细胞的集落数。重复三次,取平均值。软琼脂克隆形成实验:制备单细胞悬液备用,调整细胞密度至1× 103细胞/ml;将配制好的5%的琼脂糖进行沸水浴使其溶化,从中取出一份量的液态琼脂糖移入小烧杯中,待冷至60℃左右,迅速加入9份量预温的新鲜完全培养基,混匀后立即浇入6孔培养板中,每孔2ml,室温凝固后备用;取37℃预热的细胞悬液9.4 ml加入小烧杯中(加药处理组采用含CDDP 4 pM的培养基),加入50℃的5%的琼脂糖0.6 ml,迅速混匀后即配成0.3%琼脂糖细胞悬液,将其迅速加入铺有0.5%底层琼脂的6孔板中,每孔2ml,室温凝固;将每孔约含200个细胞的培养板置5%CO2、37℃下培养20天;使用倒置显微镜计数含50个以上细胞的克隆数,重复三次,取平均值。10.裸鼠成瘤实验裸鼠皮下成瘤模型的建立:a.实验动物:5-6周龄Balb/c裸鼠,雄性,体重15±2g,由广东省实验动物中心提供,均置于SPF环境下饲养;b.细胞处理:取生长状态良好、对数生长期的实验组和对照组细胞,以0.25%的胰酶消化,PBS洗涤三遍后,用生理盐水重悬细胞,调整其浓度为2.5×107/ml。置于冰上备用;c.肿瘤细胞皮下注射:医用碘伏消毒局部皮肤后,用1ml注射器,每组接种108/ml细胞悬液于裸鼠臀部皮下。为保证具有可比性,在裸鼠上、下肢侧随机接种,看成瘤情况;d.皮下接种瘤细胞悬液后,观察并分析各组细胞成瘤情况的差异,包括移植瘤体生长曲线、瘤体体积和重量之间的比较;e.药效学实验:待肿瘤体积长至100-300 mm3时,根据肿瘤体积随机分组后,腹腔注射法分别给予顺铂(5 mg/kg)和足叶乙甙(2.5mg/kg)两种化疗药联合应用(给药剂量参考Jaspers J,etal.Cancer Res,2015;75:732-41),每周给药一次,每隔3天用游标卡尺测量肿瘤大小,计算并比较肿瘤体积和重量,并统计裸鼠的生存时间。f.病理观察:6周后,断颈处死裸鼠,剥离瘤块,摘取肝脏和脑组织等内脏组织,备注清楚编号,液氮保存备用。11.双荧光素酶报告基因实验编码荧光素酶报告基因的psiCHECK2质粒购自美国Promega公司,psiCHECK2-H-HOTTIP-3’-UTR 和 psiCHECK2-H-EZH1-3’-UTR 野生型重组质粒以及各自相应的突变型质粒由苏州吉玛基因股份有限公司协助构建,按照1～2×105细胞/孔的细胞密度将293T细胞接种于12孔板后,应用脂质体LipofectamineTM 2000 将 40nM hsa-miR-574-5p、阴性对照 miR-NC、上述重组质粒或相应突变质粒与1 ng的psiCHECK2质粒共转染293T细胞,psiCHECK2载体被作为内参来矫正转染效率的差异。转染后48 h收集293T细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统(碧云天)进行数据分析。12.免疫组化将小细胞肺癌石蜡包埋标本切成4 μm薄片,然后脱蜡并进行抗原修复,应用内源性过氧化物酶阻断剂处理、山羊血清封闭、抗体孵育、DAB显色、苏木素复染、二甲苯透明、中性树胶封片等一系列步骤完成后,对细胞染色强度进行半定量检测,于显微镜下随机选取5个高倍视野,以核阳性染色的细胞数超过50%判定为阳性表达,根据镜下细胞综合染色情况进行评分:棕褐色判定为3分(+++),棕黄色判定为2分(++),淡黄色判定为1分(+),无着色则判定为0分(一)。13.统计学分析所有结果均经SPSS20.0软件统计处理,采用Graphpad Prism软件对分析结果作图。数据以均数±标准差(x±s)表示,计数资料两两比较采用χ2检验,计量资料两两比较采用t检验,多组间比较,方差齐则采用one-way ANOVA,方差不齐即采用Welch法;组间多重比较,方差齐采用LSD方法,方差不齐则采用Dunnett’s T3方法;采用Kaplan-Meier法进行生存分析;使用Chi-Square检验分析某个指标的表达量与各临床病理参数之间的关系;多基因表达相关性分析采用Spearman相关分析。各项实验独立重复三次,以P<0.05为差异有统计学意义。四、研究内容1.临床样本中分析HOTTIP表达与小细胞肺癌患者临床分期及预后的相关性①QRT-PCR、Western blot、免疫组化技术检测经临床验证的化疗敏感和耐药患者癌及癌旁组织中HOXA11、HOXA13和(或)HOTTIP的表达情况;②采用Kaplan-Meier法分析HOTTIP表达与患者临床分期及预后的相关性。2.明确HOTTIP在小细胞肺癌发生发展及耐药中的作用基因转染和RNA干扰技术分别增加H69、H446细胞和降低H69AR、H446DDP细胞中HOTTIP的表达水平,进行以下检测:①CCK8法分析HOTTIP与细胞化疗敏感性的关系;②CCK8法分析HOTTIP与细胞增殖的关系;③克隆形成实验分析HOTTIP与细胞增殖和耐药的关系;④利用裸鼠成瘤模型体内分析HOTTIP与肿瘤生长和耐药的关系;⑤流式细胞术分析HOTTIP对细胞周期和细胞凋亡率的影响;⑥细胞划痕实验和Transwell迁移实验分析HOTTIP对细胞迁移能力的影响。3.明确HOTTIP作为ceRNA诱导EMT参与小细胞肺癌耐药调控的分子机制①分析miR-574-5p对小细胞肺癌细胞增殖、迁移和化疗敏感性的影响;②基于生物信息学预测结果,采用qRT-PCR和Western blot进一步验证miR-574-5p可以负向调控其靶基因HOTTIP和EZH1;③双荧光素酶报告基因实验明确miR-574-5p分别与靶基因HOTTIP和EZH1的直接结合作用,并进一步证实HOTTIP是否能够与EZH1竞争结合miR-574-5p;④明确HOTTIP通过吸附miR-574-5p诱导了 EMT的产生,并进一步参与了小细胞肺癌耐药的调控。五、研究结果1.芯片结果显示,HOTTIP等多个HOXA家族成员在人小细胞肺癌多药耐药细胞株H69AR中异常高表达,miR-574-5p等多个miRNAs在H69AR细胞中异常低表达1.1 lncRNA芯片结果显示,HOTTIP等多个HOXA家族成员在H69AR细胞中异常高表达利用Arraystar公司的lncRNA芯片,分析H69AR细胞与H69细胞之间lncRNA的差异表达谱发现,在耐药细胞株中高表达的HOX家族成员有:HOTTIP上调表达倍数是14.9,HOXA13上调表达倍数是13.5,HOXA11为2.2倍的上调表达。QRT-PCR验证后发现,相对于H69细胞,HOTTIP及HOXA13、HOXA11在H69AR细胞中的差异表达倍数显著高出其他基因,分别为15.1433±0.6501、12.99±0.5411、8.23±0.2706,P<0.001,差异有统计学意义。1.2 miRNA芯片结果显示,miR-574-5p等37个miRNAs在H69AR细胞中异常低表达miRNA芯片分析发现,H69AR和H69细胞中miRNAs的表达谱存在显著差异,有85个miRNAs表达差异显著,其中包括miR-375在内的48个miRNAs在H69AR细胞中的表达显著高于H69细胞,包括miR-574-5p在内的37个miRNAs在H69细胞中的表达显著高于H69AR。接下来,通过qRT-PCR技术验证了上述结果的准确性,发现miR-574-5p在H69细胞中的表达是H69AR细胞中的3.963±0.3807倍,P<0.001,差异有统计学意义。1.3 miR-574-5p可能靶向调控HOTTIP的表达采用生物信息学网站分析发现,miR-574-5p在HOTTIP启动子区有相互结合位点,提示miR-574-5p可能通过靶向HOTTIP参与小细胞肺癌耐药。2.HOTTIP及HOXA11、HOXA13在小细胞肺癌细胞株及组织中的表达及临床病理联系2.1 QRT-PCR检测发现,HOTTIP及HOXA11、HOXA13在小细胞肺癌细胞株及经临床验证的产生了化疗抗药性的患者小细胞肺癌活检组织中显著高表达QRT-PCR 检测 HOTTIP、HOXA11、HOXA13 及其它 HOXA 家族成员(HOXA7、HOXA6、HOXA3、HOXA2、HOXA1)在 H69 及 H69AR 中的表达情况。结果显示,HOTTIP及HOXA11、HOXA13在H69AR细胞中显著高表达(P<0.01,详见结果部分)。Western blot检测H69、H69AR、16HBE细胞中HOXA11和HOXA13表达情况,结果显示,与任一组相比,16HBE细胞中两种蛋白的表达均较低;而与H69相比,H69AR中两种蛋白的表达较高(P<0.01,详见结果部分)。QRT-PCR检测临床收集的1 15例小细胞肺癌组织及癌旁组织中HOTTIP、HOXA13和HOXA11的表达情况发现,相对于癌旁组织,癌组织中HOTTIP相对表达倍数为 2.03±0.18 倍,HOXA13 为 6.34±0.22 倍,HOXA11 为 12.34±0.84倍。进一步分析发现,50例经临床验证的产生了化疗抗药性的患者癌组织内HOTTIP表达量(0.7825±0.1764)比其他50例临床化疗效果良好的患者癌组织中的表达量(0.3904±0.1665)显著增高(P<0.01);HOXA13和HOXA11同样在化疗耐药组中的表达相对较高(P<0.01,详见结果部分)。Western blot检测HOXA13和HOXA11蛋白的表达情况,结果显示,与任一组相比,癌旁组织中两种蛋白的表达均较低;而与化疗敏感患者癌组织相比,产生化疗抗药性的患者癌组织中两种蛋白的表达较高(P<0.01,详见结果部分)。2.2 HOXA13和HOXA11蛋白在临床化疗耐药患者癌组织中表达较高免疫组化技术检测100例小细胞肺癌组织(化疗耐药组和化疗敏感组各50例)及相应的癌旁肺组织中HOXA13和HOXA11蛋白的表达情况后发现,HOXA13呈阳性表达有39例,阳性表达率为78%(39/50);HOXA11 阳性表达有31例,阳性表达率为62%(31/50)。2.3采用Kaplan-Meier法分析HOTTIP表达与患者临床病理资料的关系结果发现,HOTTIP表达与性别差异无关(χ2=0.4183,P=0.5178),HOTTIP表达与患者发病年龄无关(χ2=0.5957,P=0.4402);而广泛期患者中HOTTIP阳性表达率比局限期患者明显较高(χ2=9.6084,P=0.0019),HOTTIP表达阳性患者临床化疗效果出现抗药性的比率比HOTTIP阴性表达者增加(χ2=9.6976,P<0.0018),HOTTIP表达阳性患者的中位生存时间较短,死亡率较高(χ2=23.5898,P<0.001)。2.4小细胞肺癌患者中位生存时间分析采用Kaplan-Meier法估计患者生存时间,结果发现性别与患者的生存时间无显著相关性(P=0.8306);年龄与患者生存时间无显著相关性(P=0.8198);局限期患者的生存时间长于广泛期患者,差异具有统计学意义(P<0.001);HOTTIP阴性患者的生存时间长于阳性患者,差异具有统计学意义(P<0.001)。3.HOTTIP可激活HOXA11和HOXA13的表达3.1 QRT-PCR检测发现,HOTTIP、HOXA11和HOXA13在H69AR细胞中的表达高于H69细胞(P<0.001)。3.2将HOTTIP siRNAs(siHOTTIP-1,-2,-3)和阴性对照的空载体转入H69AR和H446DDP细胞,RT-PCR检测发现siHOTTIP-1序列的沉默效果最佳,被选用进行后续短效实验;同时,我们通过慢病毒载体LV3包装siHOTTIP-1序列导入细胞获得HOTTIP稳定下调的细胞株,用来进行平板克隆实验及裸鼠成瘤等长效实验。3.3将美国斯坦福大学Wang,K.C.教授惠赠的pcDNA3.1-HOTTIP表达质粒进行质谱鉴定后,以pcDNA3.1-NC空载体为阴性对照,转染H69和H446细胞,qRT-PCR检测发现HOTTIP上调效果显著(F=14.66,P=0.0006),我们采用G418筛选后建立HOTTIP稳定过表达细胞株,用来进行部分后续体内外实验。3.4采用基因转染和RNA干扰技术分别增加和降低细胞内HOTTIP的表达,采用 qRT-PCR 和 Western Blot 技术检测发现,HOXA11 和 HOXA13 在 mRNA 和蛋白水平的表达均相应增加或降低(详见正文);而在HOTTIP沉默的细胞内利用基因转染技术增加HOXA11和HOXA13的表达后,检测发现二者在mRNA和蛋白水平的表达均显著增加。4.HOTTIP参与了小细胞肺癌细胞耐药、增殖、克隆形成、凋亡、迁移、裸鼠成瘤等生物学行为4.1 CCK8法和流式细胞术检测发现,沉默HOTTIP可显著增加细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性和细胞凋亡率,降低细胞的生存率及IC50值;反之过表达HOTTIP可显著降低细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性及细胞凋亡率,提高细胞的生存率及IC50值。4.2 CCK8法和流式细胞术检测发现,沉默HOTTIP后细胞周期紊乱,增殖能力下降;反之,HOTTIP过表达后细胞增殖能力增强。4.3克隆形成实验检测发现,沉默HOTTIP后细胞克隆形成能力下降,单个克隆内平均细胞数量减少或克隆数量减少;反之,过表达HOTTIP后细胞克隆形成能力增强,单个克隆内平均细胞数量增加或克隆数量增多。4.4细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测发现,HOTTIP沉默可显著降低细胞的迁移能力;反之,HOTTIP过表达可增强细胞的迁移能力。4.5 HOTTIP沉默可显著降低细胞成瘤能力,瘤体体积和重量显著下降;相反,HOTTIP过表达可显著增强细胞成瘤能力,瘤体体积和重量显著增加。5.HOTTIP可作为ceRNA,通过吸附miR-574-5p促进其靶基因EZH1的表达5.1 miR-574-5p与小细胞肺癌细胞增殖、迁移及耐药密切相关根据miRNA芯片结果,筛选出miR-216a和miR-574-5p可能与小细胞肺癌耐药相关。接下来,我们通过增加miR-574-5p的表达可增强细胞对化疗药物ADM、CDDP、VP-16的敏感性;抑制miR-574-5p的表达则降低细胞对上述化疗药物的敏感性;CCK8法检测发现,沉默miR-574-5p可促进细胞增殖;平板克隆实验发现细胞克隆形成能力增加;Transwell细胞迁移实验检测发现,沉默miR-574-5p可使细胞迁移能力增强。miR-574-5p过表达则抑制细胞增殖和克隆形成,细胞迁移能力亦下降。5.2 利用miRNA靶基因预测网站分析发现,miR-574-5p分别与HOTTIP和EZH1的3’-UTR区具有互补结合位点;经QRT-PCR技术验证发现,沉默细胞内miR-574-5p的表达后HOTTIP和EZH1的表达显著增加;经Western Blot技术检测发现,沉默细胞内miR-574-5p的表达后HOXA11、HOXA13和EZH1蛋白的表达均显著增加。5.3沉默细胞内HOTTIP的表达可引起EZH1表达增加而miR-574-5p表达下降;采用SPEARMAN相关分析发现,小细胞肺癌组织中HOTTIP及EZH1的表达存在显著的正相关(P<0.001)。5.4双荧光素酶报告基因实验发现,miR-574-5p可分别与HOTTIP和EZH1的启动子区的相应位点直接结合;为了检测HOTTIP是否通过miR-574-5p来调控EZH1,我们加入HOTTIP报告质粒后,miR-574-5p引起的EZH1报告质粒荧光素酶活性被抑制的情况得到逆转;突变MIR-574-5P结合位点后,逆转作用消失,进一步证实HOTTIP通过MIR-574-5P结合位点调控EZH1。5.5通过沉默细胞内EZH1和EZH2的表达我们发现,细胞对三种化疗药物的敏感性均增强,由于二者均为组蛋白甲基化转移酶,HOTTIP是否通过诱导甲基化参与了小细胞肺癌耐药?具体研究仍在进行中。6.HOTTIP可能以ceRNA的调控模式诱导了小细胞肺癌EMT6.1本课题组前期通过cDNA表达谱芯片分析发现,EMT相关分子与小细胞肺癌耐药密切相关。QRT-PCR和Western blot技术检测发现,沉默细胞内HOTTIP的表达可抑制Vimentin、Twist和Snail的表达,促进E-cadherin和β-catenin的表达,提示HOTTIP可能通过诱导EMT参与了小细胞肺癌耐药。6.2沉默H146/si-HOTTIP细胞内miR-574-5p表达后,倒置显微镜下观察细胞形态的变化:与H146及H146/si-HOTTIP细胞卵圆形、半贴壁生长的特点不同,H146/si-HOTTIP+miR-574-5p antagomirs组细胞呈细长、梭形、极性逐渐丧失,逐渐转变成具有间质细胞表型和特征的细胞。6.3将稳定沉默HOTTIP的H69AR细胞,通过转染miR-574-5p antagomirs降低miR-574-5p的表达后,采用qRT-PCR和Westen blot技术检测EMT相关上皮标记物和间质标记物的表达情况。结果显示,与H69AR/si-HOTTIP组对比,H69AR/si-HOTTIP+miR-574-5p antagomirs 组细胞内上皮标记物 E-cadherin、β-catenin表达显著降低,而间质标记物Vimentin、Twist、Snail表达显著升高。因此,HOTTIP可能通过吸附miR-574-5p诱导EMT的发生被进一步在H69AR细胞中证实。6.4 进一步研究发现,与前两组相比,H146/si-HOTTIP+miR-574-5p antagomirs组细胞迁移能力和克隆形成能力均显著增强。以上结果提示,HOTTIP可能通过吸附miR-574-5p诱导EMT参与小细胞肺癌细胞增殖和迁移。六、结论1.HOTTIP可能是小细胞肺癌独立的预后因子之一。2.HOTTIP参与小细胞肺癌多药耐药、增殖、迁移、凋亡、皮下成瘤等恶性生物学行为的调控。3.HOTTIP可能通过吸附miR-574-5p,促进EZH1表达参与了小细胞肺癌耐药。4.HOTTIP可能作为ceRNA,诱导EMT,参与小细胞肺癌耐药、增殖和迁移。综上所述,作为小细胞肺癌可能的独立预后因子之一,HOTTIP可作为ceRNA,通过吸附miR-574-5p诱导EMT的发生,广泛参与调控小细胞肺癌多药耐药、增殖、凋亡、迁移、克隆形成以及裸鼠皮下成瘤等生物学行为。