红花（Carthamus tinctorius L.）作为一类药油兼用的植物，在世界范围内广泛种植。红花花瓣—红花药材（Carthami Flos）中的活性化合物，如羟基红花黄色素A、山柰酚及其苷类、槲皮素及其苷类等，能保护心脑血管，有效防治心脑血管疾病。作为一类重要的次生代谢产物，黄酮类生物合成途径在很多植物均有研究，但有关红花黄酮类代谢的相关研究则罕见报道。一年或两年的较长生长周期，加之红花组织培养产生再生植株存在再生率低、生根困难等问题大大限制了红花功能基因研究的进程。悬浮细胞可以快速大量地增殖，且其遗传背景清晰，成为了现在研究植物次生代谢产物必不可少的研究工具。因此，建立红花细胞悬浮体系就显得非常重要。在实验室已建立的红花再生体系（1mg/LTDZ和0.1mg/L NAA的MS固体培养基）的基础上，选取生长绿色青翠且有光泽的愈伤剪碎后加入到9.31mg/L NAA和0.563mg/L6-BA的50ml的MS液体培养基，在25℃、6000lx光照、100rpm的条件下悬浮培养。每个月继代一次，直到悬浮细胞稳定。通过对红花的两个品种（新红花2号和2402052）进行悬浮细胞继代，通过测量第0天，第7天，第14天，第21天和第28天的细胞干重来衡量红花细胞生长体系。其中，新红花7号来源的悬浮细胞在21天达到最大生长量，进入细胞生长的平台期。在此基础上，利用茉莉酸甲酯刺激悬浮细胞，观察其对红花悬浮细胞生长以及次生代谢产物的影响。分别用5μM，50μM，500μM和5000μM浓度的茉莉酸甲酯刺激相应品系的红花悬浮细胞体系发现5μM的茉莉酸甲酯（MJ）能有效刺激2402052品系的悬浮细胞的生长。红花悬浮细胞体系的建立为红花的次生代谢途径以及基因功能的研究提供了平台。为了准确可靠地反映功能基因的表达情况，作为基因表达值归一化的手段，参考基因往往被引入到荧光定量PCR操作中。参考基因是一类在不同组织样本之间表达量变化不大的一类基因。而管家基因常被选做为参考基因。但不同的管家基因的表达并不是一成不变的。通过对红花54个样品中9个管家基因：CtACT （肌动蛋白），CtGAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），CtEF1（延伸因子1α）, CtTUA （α-微管蛋白），CtTUB（β-微管蛋白），CtPP2A（丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶）, CtE1F4A（真核起始因子4A）, CtBUI（泛素）和Ct60S（60S酸性核糖体蛋白）表达情况的分析，采用geNorm、NormFinder、 Ct method和BestKeeper等4种统计学算法，最终确定了其中表达最为稳定的两个基因CtBUI和Ct60S作为红花基因表达分析的参考基因。综合已有的文献研究发现，黄酮类生物合成起始于对-香豆酰辅酶A在查尔酮合酶的催化下形柚皮素查尔酮，其产物经过一系列的酶催化形成各种黄酮类化合物。在红花黄酮类代谢途径中起作用的关键酶有查尔酮合酶，查尔酮异构酶，黄酮醇合酶，二羟基黄酮醇还原酶以及糖基转移酶等。本研究在构建红花花冠cDNA文库的基础上，通过测序获得了红花花冠的32290条EST序列，经序列拼接得到UniGene共计7737条，其中有4016条contig和3721条singlets，对UniGene进行序列比对的结果，获得5646个UniGene的注释信息。根据EST文库注释结果，找出了编码黄酮类代谢途径中关键酶以及昼夜节律途径中关键酶的部分基因并以这些基因作为候选基因用于全长克隆和功能验证。其中黄酮类代谢途径中有CtCHI1177、CtCHI3626、CtGT837、CtGT1097、CtGTA09C和CtGTD07C等6个获得全长，植物昼夜节律中CtCKA2856、 CtCKB33071和CtWNK3724等基因被成功克隆出来。根据这些基因的序列设计特异的qPCR引物，用于荧光定量PCR检测这些基因在红花两个不同品种以及不同开花时期的表达情况。发现，CtCHI3626，CtGT1097以及CtGTD07C表达跟红花花期有关。其中编码查尔酮异构酶的基因，CtCHI3626在开花早期表达增高，而作为黄酮类生物代谢下游的糖基转移酶基因CtGT1097和CtGTD07C则在开花后期表达才有显著的增高。在获得关键酶全长基因的基础上，设计特异性引物克隆目的基因，将载体和目的基因连接得到重组的原核表达载体。在合适的培养条件下利用诱导剂在体外诱导目的基因的表达。通过对全长基因分析，设计相应引物，通过双酶切或者无缝克隆技术，将CtCHI533，CtCHI3626，CtGT1097以及CtGTA09C及等4个黄酮类关键酶基因和pMAl-c5x原核表达载体重组。将重组载体通过热激发转入到原核表达宿主菌BL21(DE3)pLysS中筛选阳性克隆。挑选阳性克隆液体培养至OD～0.6，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导表达融合蛋白。经亲和层析柱纯化得到重组蛋白。对重组蛋白酶切去除嵌合蛋白后获得目的蛋白。SDS-PAGE发现，CtCHI533，CtCHI3626，CtGT1097和CtGTA09C分别编码43.4kD、24.9kD、52.9kD和44.0kD的蛋白质。为后续进一步研究这些基因所编码的酶的活性奠定了基础。农杆菌转化是一种常用于植物细胞分子生物学的研究手段。对已获得的6个黄酮类关键酶基因（CtCHI1177、CtCHI3626、CtGT837、CtGT1097、CtGTA09C、CtGTD07C）以及课题组前期获得的CtCHS533基因进行分析并设计相应的引物，通过无缝克隆与载体pCAMBIA-1380-CaMV35S-MCS-EGFP-NOS(pMT39)重组构建真核表达载体，再通过电转法将重组载体导入到农杆菌LBA4404中并筛选成功得到转化的农杆菌。在不同浓度的MJ刺激红花悬浮细胞，采用Q-TOF分析其细胞内化学成分的变化。结果显示，5μM的MJ能有效地刺激红花悬浮细胞产生黄酮醇类化合物。为了进一步研究这些黄酮醇化合物的产生与CHI表达量的关系，50μM的MJ加入到悬浮细胞体系中并分别对0h，8h，16h，24h的悬浮细胞CtCHI3626基因的表达量进行测量。结果显示，MJ能有效提高编码查尔酮异构酶基因CtCHI3626的表达量。以农杆菌介导，首次利用花粉管导入法将含有目的基因的重组载体导入红花子房中，成熟后的种子在温室中栽培用于筛选阳性转化植株。以空白植株为对照，对转化植株基因组进行PCR验证和化学成分的Q-TOF分析来筛选转基因红花植株。这7个基因中，2402052品系中得到了转CtCHI3626基因的转基因植株。化学成分的Q-TOF分析发现，转基因2402052品系的叶片黄酮醇类化合物含量发生了明显的变化，其中槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷和槲皮素-3,7-O-β-二葡萄糖苷的含量与空白组相比分别提高了2.5倍和22.9倍，而山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量却降低了12.1倍。本研究初步建立了红花的悬浮细胞培养体系，并利用该体系研究黄酮类化合物的生物合成；对用于红花基因表达研究的参考基因进行系统评价，找到了适合红花基因表达研究的参考基因；克隆得到红花黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶基因并在体外成功获得其编码的蛋白质，利用qPCR分析了它们在红花不同花期以及不同品系之间的表达变化；采用花粉管导入法对红花进行遗传转化并成功获得了转CHI的红花转基因植株，发现CHI的转入，导致了红花中黄酮类化合物种类及量的明显变化。这是首次运用相关技术研究红花的黄酮类成分生物合成途径，为今后深入研究红花的黄酮类代谢途径、定向调控红花的活性成分打下了基础。