TET2/E-cadherin/β-catenin调控环路在肝癌演进中的作用研究

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肝癌死亡率高居我国癌症相关死亡率的第2位。生长速度过快、易出现转移、化疗效果差、治疗后易复发是导致肝癌死亡率高居不下的主要原因。其发病机制目前仍不十分清楚。明确肝癌迅速进展的原因,深入研究其发病分子机制,筛选和鉴定能够用于肝癌诊断、预后判断及治疗的新靶点有着深远的临床意义。大量研究表明,表观遗传学在肝癌进展中发挥重要作用。本研究中我们发现TET2在肝癌细胞中高表达,且与E-cadherin表达模式呈负相关。TET家族可以催化5mC发生连续氧化反应,羟化形成5hmC,后者经过系列变化可转化为胞嘧啶,实现DNA去甲基化。TET家族在多种肿瘤组织特别是血液恶性肿瘤中表达缺失,发挥抑癌基因的作用。在本研究中我们发现TET2在肝癌细胞中高表达,且与E-cadherin表达呈负相关,提示TET2对E-cadherin存在非去甲基化依赖的调控方式。本研究拟对TET2在肝癌中表达上调的原因及其促进肝癌进展的分子机制进行研究。我们首先利用免疫组化对TET2在肝癌组织中的表达模式进行了研究,发现TET2在肝癌组织中表达上调,TET2高表达者具有肝癌肿块大、存在肝内、外转移以及存在脉管侵犯密切相关,TET2高表达者预后不良。进一步我们利用功能获得和功能缺失实验在体内外研究了 TET2对肝癌细胞生物学行为的影响。结果显示TET2具有促进肝癌细胞增殖和侵袭转移的作用。进一步的分子机制研究中,我们采用ChIP-qPCR方法证实抑制TET2的表达或使用去乙酰化酶抑制剂(MS-275)处理肝癌细胞可以显著增加E-cadherin启动子区H3K9位点和H4K16位点的乙酰化水平,过表达TET2则可显著降低上述两个位点的乙酰化水平,进一步免疫共沉淀检测发现TET2可以与HDAC1相互结合形成复合物,揭示肝癌细胞中TET2可以通过招募HDAC1与之形成复合物,引起E-cadherin启动子区组蛋白去乙酰化,通过非甲基化途径发挥抑制E-cadherin表达的作用。进一步研究发现肝癌细胞中β-catenin转录活性与TET2的表达水平呈正相关,而与E-cadherin表达水平呈负相关,利用TCF/LEF活性报告实验,发现在肝癌细胞中,TET2高表达可显著增加β-catenin的转录活性,随之激活Wnt通路,发挥促进肝癌进展的作用。同时,我们对肝癌细胞中TET2表达上调的机制进行了研究。首先利用在线数据库JASPAR进行生物信息学预测,结果显示TET2上游具有3个TCF4潜在的结合位点,ChIP-qPCR实验证实TET2上游预测的A位点和C位点可以直接与TCF4/β-catenin结合,抑制β-catenin的表达,则TET2启动子区与TCF4/β-catenin的结合显著降低。进一步利用启动子荧光素酶报告基因实验证实,在下调β-catenin胞内水平后,TET2上游TCF4/β-catenin结合位点野生型载体转染的肝癌细胞中,荧光素酶活性显著下降,而转染结合位点突变型载体的细胞中,荧光素酶活性无明显变化,提示TET2启动子区域预测的A位点和C位点可以直接与β-catenin/TCF4转录因子结合并具有转录活性。肝癌细胞中β-catenin活性增加可引起TET2的转录激活,从而引起TET2的表达上调,形成TET2/E-cadherin/β-catenin正反馈环路,促进肝癌的进展。
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