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载脂蛋白B是低密度脂蛋白(LDL)和乳糜微粒(CM)的必须成分,负责甘油三酯和胆固醇转运,其中LDL是人体血浆胆固醇的主要转运者。人体内主要有两种形式的载脂蛋白B:Apo B-100和ApoB-48。二者产生自同一基因。ApoB mRNA编辑使ApoB-100 mRNA第6666位上的C变成了U。此处编码谷氨酰胺的CAA密码子变成UAA终止密码子,导致截短的ApoB-48生成。ApoB-48形成的脂蛋白不参与LDL的形成,而更快速地得以清除。血浆LDL的低水平,则降低了基于高LDL-胆固醇的动脉硬化等疾病的发生风险。对ApoB mRNA编辑的研究,显然于RNA编辑的机制及基于高胆固醇导致的动脉硬化症等方面的探索具有重要意义。 目前ApoB mRNA编辑的研究主要是基于特定细胞类型在RNA水平上的研究,是基于原始细胞材料的高背景检测。且由于RNA提取的不稳定、繁琐等因素,难以实现RNA编辑的高通量检测。本实验利用ApoB mRNA编辑针对保守序列产生终止密码子的特征,构建了编辑保守序列两侧分别带荧光蛋白(DsRed/GFP)基因的ApoB表达载体,以之转染Caco-2和CBRH-7919细胞,发现转染细胞呈现出绿色和黄色两种颜色类型,提示编辑发生细胞之间存在异质性。 经细胞分选并对分选后的两色细胞分别培养后,发现绿色细胞群中出现了黄色细胞,而黄色细胞群里也有绿色细胞出现,提示编辑的细胞间异质性并非来自遗传决定机制,而是由细胞的动态因素决定的。 进一步用细胞周期阻断剂秋水仙素将细捕获在M期,转染之后的细胞在共聚焦显微镜观察发现,两种细胞大多呈绿色,其去除秋水仙素后,继续培养30小时,随机观察发现绿色细胞群体中出现了较多黄色的细胞。通过流式细胞仪的定量分析,M期捕获及释放的转染细胞,Caco-2和CBRH-7919细胞黄色细胞占所有有色细胞的比例相比较对照分别下降了14%(p<0.01)和6%(p<0.01);而将细胞从M期中释放之后,Caco-2和CBRH-7919细胞黄色细胞占所有有色细胞的比例相比较M期捕获的又显著增加8.9%(p<0.01)和16.8%(p<0.01)。流式细胞仪检测证实了激光共聚焦显微镜观察的结果。两种方法共同确证了载脂蛋白B RNA编辑的发生存在细胞异质性的特点,并指出这种异质性来自于细胞周期,即载脂蛋白B mRNA在不同细胞周期中的编辑发生情况不同。这初步提示了ApoB mRNA编辑发生的发育阶段特征与细胞周期有关。 本实验构建了高通量ApoB mRNA编辑检测体系,能够根据颜色的变化直接观察编辑在细胞中的发生,编辑程度的改变可以通过流式细胞仪检测,初步揭示了载脂蛋白B基因的编辑是依赖细胞周期的动态过程,为探索载脂蛋白B RNA编辑的研究提供了新思路。