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背景卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是侵袭性强的妇科肿瘤。由于早期缺乏特征性症状,多数患者就诊时已处于中晚期,且在首次治疗后会经历复发。目前大部分患者得益于多线治疗而非有效的一线治疗,表明引入新疗法以延长首次进展和总体生存时间仍然是临床研究的关键目标。但对于靶标分子的选择和治疗方法的应用依赖于对卵巢癌发生发展机理更深入的理解。表观遗传是在不改变DNA基本序列的前提下通过调控基因组与环境之间的相互作用而将基因表达或功能改变进行的稳定遗传。基因表观遗传学的改变对肿瘤形成至关重要,往往在疾病的早期就显示出异常。卵巢肿瘤发生在很大程度上由表观遗传变化介导,但目前研究多集中于DNA甲基化和组蛋白修饰,转录后RNA修饰、非编码RNA调控等在卵巢癌中的作用和机理仍是需探索的领域。6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物mRNA中最丰富的表观转录组学修饰。在mRNA加工、运输、翻译、稳定性等多个过程中发挥作用,其动态可逆的变化控制并决定着细胞生长和分化。以微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)为代表的非编码RNA是转录后水平上基因表达的关键调节因子。miRNA是mRNA的去稳定剂和阻遏物,lncRNA可作为竞争性内源RNA或miRNA“海绵”来调节肿瘤中关键基因。因此本研究以卵巢癌中m6A RNA甲基化修饰改变,以及非编码RNA对卵巢癌关键癌基因的调控为切入点,旨在从转录后表观遗传层面为卵巢癌的致病机理和治疗方向探索新的靶标。方法本研究主要分为两个部分。第一部分中,利用甲基化检测试剂盒定量检测35例卵巢癌组织标本和5种卵巢癌细胞系中m6A修饰水平,荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹(westernblot)实验检测5种m6A修饰调控酶mRNA和蛋白的表达,Oncomine和GEPIA网站分析TCGA卵巢癌数据库生存与预后信息;利用小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒在卵巢癌细胞中敲低或增加m6A去甲基化酶alkB同系物5(alkB homolog 5,ALKBH5)的表达,分别检测对肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭功能的影响;对过表达ALKBH5的卵巢癌细胞进行RNA甲基化免疫沉淀测序(MeRIP-seq)和转录组测序(RNA-seq),联合分析测序数据;检测31例初诊卵巢癌和37例健康对照者外周血细胞的m6A修饰水平,使用受试者工作曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)评价其诊断效能,并分析与血清肿瘤标志物糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)的相关性。第二部分研究中,使用 miRWalk、Starbase、DIANA、LncACTdb 网站和 miRNA芯片进行生物信息学分析,筛选卵巢癌中调控关键癌基因NOTCH受体蛋白3(notch receptor 3,NOTCH3)的潜在miRNA和lncRNA,利用双萤光素酶报告基因实验来验证其相互作用。采用qPCR检测miRNA、lncRNA和相关基因的mRNA的表达量,western blot检测蛋白表达水平;通过转染miR-1299模拟物(mimics)或抑制物(inhibitors),感染牛磺酸上调蛋白 1(taurine up-regulated 1,TUG 1)短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒,经细胞功能实验和动物实验研究miR-1299和lncRNA TUG1对卵巢癌肿瘤细胞增殖和细胞周期的影响。使用相关性分析和药物毒性实验来研究NOTCH3对TUG1表达的影响。结果第一部分的研究发现,卵巢癌组织相较于正常卵巢组织m6A RNA甲基化水平显著升高(0.033%vs.0.026%,P<0.001),而去甲基化酶ALKBH5的下调介导了 m6A修饰的上调,并且与临床分期与生存预后相关。ALKBH5调控着卵巢癌细胞系中m6A水平的动态变化,过表达ALKBH5能抑制卵巢癌细胞的增殖、促进其凋亡并引起G0G1期周期阻滞,而敲低ALKBH5则起到相反的效应。甲基化和转录组测序结果提示,ALKBH5的抑癌效应与细胞周期和增殖相关基因及通路密切相关。卵巢癌外周血细胞中m6A修饰水平同样显著升高(0.085 vs.0.052%,P=0.004),与血清肿瘤标志物CA125呈有统计学意义的正相关(r=0.330,P=0.046),并且可以较好地将卵巢癌患者与健康个体区分开来(AUC=0.795,95%CI 0.713-0.876,P<0.001)。第二部分的研究表明,miR-1299是卵巢癌中癌基因NOTCH3的负调控因子,在卵巢癌组织中显著下调,与肿瘤分化程度密切相关。miR-1299的上调显著抑制了卵巢癌细胞增殖、集落形成和DNA合成,并诱导肿瘤细胞发生G0G1期周期停滞。在异种移植小鼠模型中过表达的miR-1299能有效抑制肿瘤的体内生长。lncRNA TUG1可充当miR-1299的海绵,作为内源RNA竞争性吸附miR-1299而上调NOTCH3的表达,从而促进卵巢癌恶性增殖。lncRNA TUG1同时是NOTCH3基因的潜在下游靶标,在卵巢癌的进展中形成miR-1299/NOTCH3/TUG 1的反馈环路。结论去甲基化酶ALKBH5通过抑制卵巢癌细胞增殖、诱导其凋亡、引起细胞周期阻滞来发挥抑癌效应,其表达下调介导了卵巢癌中m6A甲基化修饰的异常升高,且外周血细胞m6A修饰水平是卵巢癌潜在的生物标志物。lncRNA TUG1通过竞争性吸附miR-1299上调NOTCH3基因从而促进卵巢癌恶性增殖。该发现增进了非编码RNA调控关键癌基因引起卵巢癌发病机制的了解,有利于针对miRNA和lncRNA定向诊断和治疗方法的开发。