槟榔间座壳叶斑病病原鉴定及其真菌病毒的全基因组克隆和结构分析

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槟榔(Areca catechu L.)属于棕榈科(Palmae),是海南省重要的经济作物之一。槟榔也是珍贵热带药用植物,是我国四大南药之首。随着种植面积的不断扩大,由于传统种植区域出现土地资源减少,加上多年种植,以及栽培管理不当等,叶斑病已成为制约槟榔产业可持续发展的因素之一。本文首次对槟榔间座壳叶斑病进行了系统性研究,包括病原鉴定、生物学特性以及真菌病毒的全基因组克隆和对寄主的影响,已取得的研究结果如下:槟榔间座壳叶斑病主要为害叶片,起初叶片的症状为褪绿的小黄斑点,随着病斑的扩展,病斑中部为黑色并伴有黄色晕圈,椭圆形或不规则形的病斑。随着病斑不断的扩展,病斑内部黑色,中间深灰白色,边缘浅棕色并伴有黄色晕圈,病斑上散生许多小黑点。最终,坏死点扩大,逐渐变灰白色,然后合并形成更大的坏死区域。病原菌经过分离培养、单孢纯化、致病性测定、形态学鉴定及联合(ITS、TUB、CAL、TEF和HIS)构建系统发育树,结果表明引起槟榔间座壳叶斑病的病原菌有Diaporthe pseudophoenicicola、D.limonicola和D.ueckerae。对槟榔间座壳叶斑病菌的生物学特性进行研究,PDA培养基为病原菌HNWC01、HNQH01和HNQH02菌丝生长的最适培养基,菌丝生长的最适温度均为28℃,最适p H均为7,光照对菌丝的生长无影响。对采集的14株槟榔间座壳叶斑病菌株的菌丝进行双链RNA(double stranded RNA,ds RNA)的提取,发现HNWC02菌株中含有6条ds RNA片段,随机克隆以及末端克隆测序显示,每条片段分别长3335 bp、3039 bp、3030 bp、2980 bp、963 bp和780 bp。分析推测,ds RNA-1、ds RNA-5和ds RNA-6含有一个独立的开放阅读框,分别为ORF1、ORF8和ORF9;ds RNA-2、ds RNA-3和ds RNA-4含有两个开放阅读框,ds RNA-2为ORF2和ORF3,ds RNA-3为ORF4和ORF5,ds RNA-4为ORF6和ORF7。其中,ORF1编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp)结构域,ORF3编码衣壳蛋白(CP),其余的ORF编码未知功能的蛋白。病毒粒体球形,直径大小约为40 nm。基于病毒的Rd Rp和CP构建系统发育树,结果表明Dp CV1与Pr CV1、Bb CV1011和Ij CV-1聚为一支,隶属于产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)的I簇的分支,是产黄青霉病毒科的一个新成员。通过单孢分离实验获得了Dp CV1的等基因系脱毒菌株,带毒菌株的菌丝生长速度变缓,产色素能力增强,致病力下降,对咪鲜胺药剂抗药性减弱和菌丝产生膨大结构,结果表明Dp CV1具有生物防治槟榔间座壳叶斑病的潜能。以上研究结果为槟榔间座壳叶斑病病害的防控提供了相关的理论依据,对海南省槟榔产业的健康可持续发展具有重要指导意义。
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