【研究背景】血管是体内分布最广的重要器官,起着运输氧气和营养物质,带走代谢废物,调节血液循环和组织稳态的重要作用,同时也是肿瘤的标志性特征和肿瘤干预的重要靶点。目前公认的通过肿瘤血管达到治疗肿瘤目的的策略主要有两种,即“抑制血管生成策略”和“肿瘤血管正常化策略”。然而单纯抑制血管生成会使肿瘤耐药问题和毒副作用日益明显,因此近年来的观点提出,在肿瘤生长的某个阶段促进肿瘤血管结构与功能的正常化,从而改善肿瘤微环境,抑制肿瘤的发展。核糖体是细胞内合成蛋白质的重要细胞器,由核糖体RNA和蛋白质组成,核糖体RNA在细胞核仁内由核糖体DNA转录而来,当核糖体DNA的转录受到抑制时,细胞内核糖体合成受阻,进一步影响细胞内蛋白质合成稳态。肿瘤内皮的单细胞测序结果显示,肿瘤内皮中核糖体的表达高于正常内皮,但核糖体合成对于肿瘤内皮的影响还需要进一步的研究。SPEN是在多种细胞类型中广泛表达的核蛋白,与Wnt、Notch等多个信号通路存在相互作用,同时与Xist结合并招募组蛋白去乙酰化酶,直接参与X染色体灭活过程。然而,SPEN在血管发育中的作用尚未报道。那么,SPEN是否在血管发育和肿瘤血管形成中发挥作用,其发挥作用的机制又是什么呢?回答以上问题可以揭示血管形成新的分子调控机制,为肿瘤血管靶向治疗提供新靶点和新策略。【研究目的】本研究拟明确SPEN在生理性和肿瘤血管发育中的作用、对内皮细胞的主要影响,以及其在血管发育中发挥作用的分子机制,同时基于SPEN作用于内皮细胞的靶点开展转化研究。【研究方法和研究结果】1.SPEN在血管内皮细胞核中普遍表达。通过对C57BL/6J野生型小鼠进行组织免疫荧光染色,发现在小鼠肺脏、肾脏、脑、心脏、肝脏和视网膜中,SPEN均与内皮标记物存在共定位,且高表达于内皮细胞核上。同时,qRT-PCR结果显示,SPEN随着视网膜血管网的发育以及肿瘤的发展,在内皮细胞上的表达逐渐提高。2.内皮细胞SPEN敲除抑制生理性新生血管形成。通过在内皮细胞特异性SPEN敲除小鼠上构建视网膜血管发育模型,免疫荧光染色观察到内皮细胞SPEN敲除后,视网膜血管网的密度明显下降,血管网生长前端出芽数目减少。Brd U掺入实验证实,内皮细胞SPEN敲除后视网膜血管网的增殖能力下降。进一步建立皮下基质胶模型,Masson染色结果显示,内皮细胞SPEN敲除后,血管向基质胶内生长的能力下降。3.内皮细胞SPEN敲除抑制肿瘤生长和转移,促进肿瘤血管正常化。在内皮细胞SPEN敲除小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞系和B16F10黑色素瘤细胞系建立皮下荷瘤模型,观察到在两种荷瘤模型中,肿瘤的生长都明显受到抑制。同时,LLC荷瘤小鼠肿瘤转移减少,小鼠生存期延长。通过免疫荧光染色对肿瘤内部血管的结构和功能进行分析,观察到内皮细胞SPEN敲除后,血管的密度减少,α-SMA、NG2和SM22阳性的周细胞以及Laminin标记的基底膜覆盖量增加,血管的渗漏能力下降、灌流能力增加、肿瘤内部缺氧程度下降。扫描电镜结果显示,内皮细胞SPEN敲除后,血管内壁更加平整。同时,在内皮细胞SPEN敲除小鼠接种LLC后联合化疗药物顺铂进行治疗,H＆E染色结果显示肿瘤内部的坏死程度增加。4.内皮细胞SPEN敲除改善肿瘤免疫微环境。利用全肿瘤RNA样本进行qRT-PCR检测,发现肿瘤内部IFNγ和TNFα的表达水平上升。通过FACS分析肿瘤内部主要免疫细胞的比例和数目,发现在内皮细胞SPEN敲除后,肿瘤内部总CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例和数目均明显上升。进一步利用FACS分选出肿瘤内部CD8+T细胞,qRT-PCR检测到内皮细胞SPEN敲除后,CD8+T细胞IFNγ的表达上升,这一结果也通过FACS进行胞浆染色分析得到了证实5.SPEN敲减抑制内皮细胞增殖、迁移及体外血管生成。在体外利用包装sh RNA的慢病毒感染原代HUVEC细胞的表达后,观察到内皮细胞体积明显增大。Ed U增殖实验和FACS细胞周期检测证实,内皮细胞敲减SPEN后增殖能力受到抑制。划痕实验和Transwell迁移实验证实,内皮细胞敲减SPEN后迁移能力受到抑制。同时,在活细胞工作站下观察发现,内皮细胞敲减SPEN后细胞的运动能力下降。进一步利用免疫荧光染色发现,敲减SPEN后,内皮细胞板状伪足减少而应力纤维的形成增加。平面管腔形成实验和内皮细胞出芽实验显示,内皮细胞敲减SPEN后管腔成环数减少且出芽数目下降。6.内皮细胞中SPEN发挥作用依赖于P53信号通路。将敲减SPEN后的HUVEC细胞和磁珠分选得到的肿瘤内部CD31阳性内皮细胞进行基因表达谱测序,测序结果分析显示,P53信号通路在体内外SPEN干预后变化最为显著,qRT-PCR和Western Blotting以及报告基因实验都对这一结果进行了证实。体外在HUVEC细胞sh SPEN的基础上sh P53或sh P21,发现SPEN敲除后对内皮细胞增殖的抑制作用解除,细胞运动能力和体外形成血管的能力恢复。通过在体内内皮细胞SPEN敲除后诱导P53半倍剂量敲除,观察到内皮细胞SPEN敲除后所引起肿瘤生长抑制、肿瘤血管正常化、T细胞浸润的增加以及CD8+T细胞IFNγ产生的增加等表型都得到了挽救。7.内皮细胞SPEN敲减引起核仁应激,进而激活P53信号通路。对敲减SPEN后HUVEC的测序结果进行分析,发现核糖体相关子集在对照组显著富集,具体表现为合成核糖体大小亚基的合成基因在内皮细胞SPEN敲减后一致下降,通过qRT-PCR也对其中核糖体大亚基合成基因RPL5、RPL11和RPL23的表达下调进行了验证。通过免疫荧光染色对敲减SPEN后HUVEC的核仁结构进行分析,发现NPM1由核仁内转位至核仁外,核仁碎片化形成“核仁项链”结构。进一步利用CHX抑制蛋白质合成,发现敲减SPEN后P53的蛋白质降解速率下降。同时Western Blotting以及内源性免疫共沉淀结果也证实,HUVEC中敲减SPEN后P53入核能力增强,P53与MDM2的结合能力下降。8.内皮细胞SPEN敲减促进p RNA转录,改变r DNA染色质修饰状态,降低r RNA合成。在HUVEC中敲减SPEN后检测r RNA合成的情况,发现pre-r RNA的表达量下降,同时r RNA成熟体18S、28S和5.8S的表达也随之下降,且pre-r RNA表达的下降先于P53信号通路的变化。染色质免疫共沉淀结果证实,HUVEC中敲减SPEN后r DNA基因启动子处活化型染色质修饰下降、抑制型染色质修饰上升,同时RNA聚合酶Ⅰ转录复合体在r DNA上的结合下降,这是由于SPEN对于r DNA基因启动子处p RNA的转录抑制作用解除而引起的。9.RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX5461可以在一定条件下促进肿瘤血管正常化。分离C57BL/6J野生型小鼠的肺内皮细胞和不同时间点Lewis肺癌细胞系皮下荷瘤小鼠的肿瘤内皮细胞,通过qRT-PCR检测发现,与SPEN的表达变化相似,随着肿瘤的发展,肿瘤内皮中r RNA的表达量逐渐增加。通过口服灌胃对小鼠进行RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX5461不同条件给药,发现一定条件下CX5461可以促进肿瘤血管结构和功能正常化,同时促进肿瘤内部T淋巴细胞的浸润,增强化疗药物顺铂和抗PD-1抗体的疗效。【研究结论】内皮细胞SPEN干预可以通过抑制核糖体DNA的转录诱发核仁应激,进而激活P53信号通路,使内皮细胞增殖能力下降,在生理条件下抑制血管发育,在肿瘤血管发育过程中促进肿瘤血管正常化,促进T淋巴细胞的浸润和CD8+T细胞IFNγ的产生。以此为理论依据,发现RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX5461可以在一定条件下促使肿瘤血管结构与功能的正常化,同时促进肿瘤内部T淋巴细胞的浸润,增强化疗药物顺铂和抗PD-1抗体的疗效。