拟除虫菊酯是一类人工合成的类似天然除虫菊酯的化合物。拟除虫菊酯类农药对鱼类、蜜蜂和水生无脊椎动物等非靶标生物毒性较高；而且,它对哺乳动物的生殖、神经、免疫、内分泌和心血管系统有明显的毒副作用。来源于Sphingobium wenxiniaeJZ-1的菊酯水解酶PytH是一种高效、广谱的拟除虫菊酯降解酶。解析其三维结构,可以使我们从分子水平上理解PytH降解菊酯的机制,为今后利用、改造菊酯类农药、菊酯降解酶及降解菌株提供了重要信息。本研究以质粒pET29a-pytH为模板,PCR扩增出pytH基因,将其克隆至表达载体(pET24b)后,在大肠杆菌中进行高效异源表达,并用Ni2+亲和层析方法纯化表达产物,结果体外可以纯化到大量(20mg每升菌)高纯度的具有生物活性的PytH蛋白。将纯化到的蛋白浓缩至20mg/mL,运用气相扩散方法,成功筛选到两个蛋白结晶条件(114-36:O.lmol/L HEPES Sodium pH7.5, lmol/L Sodium citrate tribasic dihydrate; 110-16:O.1mol/L HEPES Sodium pH7.5,1.5mol/L Lithium sulfate monohydrate),这两种蛋白结晶条件经优化后,我们分别对野生型蛋白及野生型蛋白与联苯菊酯的复合物进行结晶,获得了PytH野生型蛋白的晶体及其与底物联苯菊酯复合物的晶体,并分别收集到2.81A和2.39A的衍射数据。PytH与已发现的菊酯类水解酶没有任何一致性,NCBI基酸序列比对结果显示其与来自蓖麻的酯酶PIR7B的一致性最高仅约为33%。对结构数据库中的结构的比对结果显示,在PDB数据库中PytH和来源于烟草的水杨酸结合蛋白SABP2 (PDB:1Y7HD)的一致性最高,但仅有21%一致性(截止2013年5月31日)。我们尝试用分子置换的方法解析其结构,但未能成功,因此,为了解析PytH蛋白的晶体结构,我们制备了PytH硒代甲硫氨酸衍生蛋白晶体,并收集到1.96A的衍射数据,运用Se-SAD的方法成功确定了PytH蛋白的相位,并解析了拟除虫菊酯类农药降解酶PytH的晶体结构。PytH与联苯菊酯复合物晶体的空间群为P4(2)2(1)2,每个不对称单元中含有6个PytH单体分子。每个PytH单体分子由14个a螺旋和9个p折叠组成,每两个p折叠之间至少有一个α螺旋,并有若干个平行的α/β结构,这是一个典型的α/β水解酶家族成员。