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吸烟是呼吸系统疾病的重要危险因素。香烟烟雾刺激正常人呼吸道上皮细胞,可诱导白细胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)的表达增加。IL-8基因顺式调控元件内有包括核转录因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和CCAAT/增强子结合蛋白-β(CCAAT/enhancer binding protein-β, C/EBPβ)在内的多个核因子结合位点。但有关NF-κB和C/EBPβ在香烟烟雾诱导IL-8基因转录活化的细胞内信号传导途径中的作用尚不清楚。目的该研究用香烟烟雾凝集物(cigarette smoke extracts, CSE)刺激人支气管上皮BEAS-2B细胞,观察CSE对BEAS-2B细胞的损害作用和对细胞炎症因子IL-8表达的影响。利用IL-8促进子上的NF-κB, C/EBPβ结合位点突变细胞株(IL-8mNF-κB-BEAS-2B cells,IL-8mC/EBPβ-BEAS-2B cells),细胞中被激活的NF-κB, C/EBPβ不能与IL-8促进子结合。通过比较CSE刺激后,NF-κB, C/EBPβ结合位点突变BEAS-2B细胞与野生型BEAS-2B细胞(IL-8 WT BEAS-2B cells)中与IL-8促进子相连的荧光素酶(luciferase,fLCF)基因表达量的变化,观察NF-κB和C/EBPβ转录因子在CSE引起的人支气管上皮细胞IL-8表达变化中的作用。为进一步探讨吸烟导致呼吸系统炎症发生机制提供实验依据。实验方法1 CSE溶液的配制CSE原液的制备参照Su Y的方法并改良,CSE原液用无血清RPMI-1640培养液稀释,配制好的CSE于30min之内用于实验。2 MTT比色法测CSE溶液对BEAS-2B细胞的半数抑制浓度用0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%的CSE溶液刺激BEAS-2B细胞,测定不同浓度的CSE对BEAS-2B细胞的抑制作用,并得出CSE溶液的半数抑制浓度。3 CSE处理正常BEAS-2B细胞及IL-8基因mRNA表达水平检测根据MTT测定的结果,分别以浓度0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的CSE作用正常BEAS-2B细胞,通过荧光定量PCR,分析不同浓度CSE处理后细胞IL-8 mRNA水平的变化。4 CSE处理3种突变型BEAS-2B细胞及其fLCF mRNA表达水平检测根据CSE处理正常BEAS-2B细胞后IL-8基因表达的变化,用7.5%CSE作用3种突变型BEAS-2B细胞,通过荧光定量PCR,分析CSE处理后,细胞fLCF mRNA水平的变化。5荧光素酶活性测定以试剂盒中报告基因细胞裂解液为空白对照,测定7.5%CSE作用的正常BEAS-2B细胞和3种突变型BEAS-2B细胞的荧光素酶活性。结果1 BEAS-2B细胞的形态学观察CSE刺激支气管上皮细胞来源的BEAS-2B细胞,可导致BEAS-2B细胞形态改变。CSE处理后,细胞胞浆疏松,漂浮细胞增多。随着CSE浓度的增加,细胞受损情况也越严重。2 7.5%CSE处理3种突变型BEAS-2B细胞,细胞绿色荧光的变化3种突变型BEAS-2B细胞受到CSE作用后,荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞减少,细胞回缩变圆。3 MTT检测结果CSE对BEAS-2B细胞的生长有显著的抑制作用,F=25.06,P<0.001。且随着药物浓度的增加,CSE对细胞的抑制作用增强,呈剂量-效应关系。CSE对BEAS-2B细胞的半数抑制浓度约为7.5%。4 BEAS-2B细胞IL-8 mRNA在不同浓度CSE作用后的RT-PCR检测结果CSE作用BEAS-2B细胞,可导致其炎症因子IL-8表达增加,单因素方差分析表达差异有统计学意义(F=1808.1,P<0.001)。低浓度(2.5%、5.0%和7.5%)的CSE刺激增加IL-8 mRNA的表达(P<0.001),且具有浓度依赖性增高；但是10.0%CSE处理组大量细胞死亡,其IL-8 mRNA表达量与无CSE处理组间差异无统计学意义(P>0.05)。5 7.5%CSE作用3种突变型BEAS-2B细胞fLCF mRNA的RT-PCR检测结果7.5%CSE作用后,IL-8mNF-κB-BEAS-2B细胞和IL-8mC/EBPβ-BEAS-2B细胞的fLCF mRNA表达量都较IL-8 WT BEAS-2B细胞低,且IL-8 WT BEAS-2B细胞fLCF mRNA表达量是IL-8mNF-κB- BEAS-2B细胞fLCF mRNA表达量的1.32倍,是IL-8mC/EBPβ- BEAS-2B细胞的fLCF mRNA表达量的1.54倍。6荧光素酶活性测定相同浓度和作用时间的CSE刺激,IL-8mNF-κB- BEAS-2B细胞和IL-8mC/EBPβ- BEAS-2B细胞的荧光素酶活性都较IL-8WT BEAS-2B细胞低,且差异有统计学意义(P<0.001)。结论NF-κB转录因子参与CSE诱导的IL-8基因转录活化的细胞内信号传导过程。该研究首次证实C/EBPβ转录因子参与CSE诱导的IL-8基因转录活化。提不NF-κB和C/EBPβ转录因子通过参与炎症因子IL-8表达,促进吸烟导致的呼吸系统炎症反应。