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氯代硝基苯酚化合物(Chlorinated nitroaromatic compounds,CNPs)广泛应用于工农业化学品,如杀真菌剂、杀虫剂、染料等的生产。由于强吸电子基团硝基和氯离子的取代,CNPs化学性质稳定,在环境中半衰期长,不易被降解。CNPs对人和动物高毒,部分CNPs还有具有致畸、致癌性。CNPs的污染主要来源于工业生产中废弃物的不规范排放,导致对水体、土壤和大气造成严重的污染,严重损害人类健康以及整个生态系统的安全。微生物是环境中污染物降解的主力军,利用微生物降解CNPs进行原位修复是一种经济、安全、有效且没有二次污染的方法,具有非常广阔的应用前景。目前关于微生物降解2,6-二氯-4-硝基苯酚(DCNP)的报道非常少,其降解途径和降解机制尤其是脱卤机制研究尚处于空白状态。本论文拟以DCNP为目标化合物,分离、筛选出高效降解菌株,研究其降解机制,克隆DCNP的降解基因(簇),从分子水平阐明菌株降解DCNP完整的代谢途径和分子机制,为CNPs的微生物降解提供理论指导,为CNPs污染的微生物修复提供技术支持。从苏州第一农药厂和昆山绿利来农药厂采集土样,经过连续的富集培养,从中分离筛选出一株DCNP高效降解菌株,命名为菌株22-1。经过16SrRNA基因序列分析,构建系统发育树,将菌株22-1鉴定为Ensifer属。降解试验研究表明菌株22-1能利用DCNP作为唯一碳源、氮源和能源生长,并可将其彻底降解。对菌株22-1的降解特性研究发现,最适降解温度为25℃;最适降解pH值为8.0;另外,1mM的Fe3+、Mn2+和Ca2+均可以促进菌株22-1的降解,其他的金属离子,比如Co2+、Cu2+等对降解速率有显著的抑制作用。采用第二代测序技术Illumina Miseq对菌株22-1全基因组进行测序,借助生物信息学手段,通过与GenBank数据库及微生物代谢专业数据库(KEGG,UM-BBD)进行比对和分析,预测了参与DCNP降解的基因簇,包含的基因有:cnpA,2,4,6-trichlorophenol monooxygenase;cnpB,NAD(FAD)-dependent dehydrogenase;cnpC,putative NAD(P)H-dependent FMN reductase;cnpD,catecho1 1,2-dioxygenase;cnpE,FMN adenylyltransferase;cnpR,LysR family transcriptional regulator;orf1,maleylacetate reductase。在这一系列的基因当中,预测cnpA是菌株22-1降解DCNP的关键酶基因,所以通过对cnpA基因的敲除来验证预测的基因簇的功能。发现,当cnpA基因被成功敲除之后,获得的突变株22-△cnnpA失去了降解DCNP的功能,从而验证了预测的基因簇确实参与了 DCNP的降解。把野生型菌株22-1和突变株22-△cnpA用不同的底物处理后,提取总RNA,反转录生成cDNA。实验中设计了 8对引物,每对引物的理论扩增长度是500-1000 bp之间,这些片段之间相互重叠,这样扩增片段可以将整个cnpBADCE基因簇覆盖。PCR结果显示,直接以RNA作为模板,8对引物都没有扩增出目的片段;相反,以反转录合成的cDNA作为模板,8对引物都能扩增出相应的目的片段,这表明,cnpB、cnpA、cnpC和cnpE这5个基因确实处于同一个转录单元中,他们是共转录关系。从菌株22-1中克隆到了编码氧化还原酶CnpAB的基因(cnpA和cnpA)片段,通过EcoliBL21(DE3)异源表达和镍柱亲和层析。发现,单一组分都没有显示出对底物DCNP降解活性,只有两组分组合在一起,并添加辅因子NADPH,才能显示出对底物DCNP降解活性。表明CnpA需要CnpB提供还原力氢和电子。CnpAB的酶学特性研究发现,CnpAB的最适反应温度是30℃,最适pH是8.0。O.1mM的Ni2+、Zn2+和Fe3+对酶有强烈的抑制作用,0.1mMCa2+、Cu2+、K+、A13+、Mn2+、Co2+对酶也有一定的抑制作用。将CnpAB反应后的上清进行萃取,进行衍生化实验。通过气相质谱进行产物鉴定,推断菌株22-1降解DCNP的代谢途径是:DCNP在氧化还原酶的作用下转化为2,6-二氯对苯二醌,进一步水解生成2-羟基-6-氯苯醌,在还原酶的作用下生成6-氯偏苯三酚,最后开环进入TCA循环实现降解。