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常见的肾小球疾病的病理类型包括局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis，FSGS)、微小病变型肾病(minimal change disease，MCD)和膜性肾病(membranousnephropathy，MN)等。足细胞损伤是肾小球疾病的重要机制之一,本课题组前期研究证实,线粒体功能障碍是足细胞损伤的始动因素,亦是导致肾脏疾病的重要原因之一。近年来研究显示miRNA参与了肾脏疾病的发生与发展。2008年,Thum等人首次报道了 miR-21在心脏中的抗纤维化作用。此后,miR-21在急性肾损伤、糖尿病肾病、慢性肾脏病和肾脏纤维化中的作用得到了广泛的研究。但miR-21在足细胞中的作用尚不明了,需要进一步研究。第一部分miR-21在PAN诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍中的作用目的:探讨miR-21在PAN诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍中的作用。方法:1.选择20只雄性SD大鼠按照每组10只随机分为对照组(sham)、模型组(PAN),模型组大鼠予一次性尾静脉注射150mg/kg嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)建立大鼠肾脏病模型,对照组大鼠同时予一次性尾静脉注射等容量生理盐水。于第13天将大鼠置于代谢笼,收集24小时尿液,第14天集中处死大鼠,留取双侧肾皮质用于后续实验。2.体外培养小鼠足细胞系(MPC5),用不同浓度的PAN(25、50、75、lOOμg/ml)刺激,对照组(con)予生理盐水。3.体外培养MPC5,分为对照组(vehi)和miR-21过表达组(miR-21OE),miR-21 过表达组予转染试剂 siRNA-mate 与 miR-21 mimicss共转染细胞,siRNAmate浓度为2μl/ml,miR-21 mimicss浓度为20nM,对照组予等量转染试剂及阴性对照序列(negative control)。Bradford法检测24小时尿蛋白总量;应用透射电镜观察肾小球足细胞的超微结构；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)法检测足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin的表达,检测线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数的变化,检测miR-21的表达。蛋白质印迹法(western blot)检测nephrin和podocin的表达;采用荧光探针DCHFDA染料检测细胞ROS的产生;流式细胞术检测线粒体膜电位;应用AnnexinV-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.PAN可诱导SD大鼠出现蛋白尿及足细胞损伤,且可诱导miR-21表达升高。尿蛋白检测结果显示PAN组大鼠24小时尿蛋白定量较sham组显著升高。电镜下,PAN组大鼠足细胞足突融合甚至足突消失,足细胞发生形态改变,出现微绒毛,液泡和质膜扩大,大量电子致密颗粒出现在足细胞胞质中。模型组大鼠肾皮质nephrin与podocin表达量、mtDNA拷贝数较对照组显著降低,miR-21表达量则明显增加。2.PAN呈剂量依赖性地诱导足细胞损伤,浓度为50μg/ml时,nephrin与podocin表达量是对照组的60%,浓度为100μg/ml时,nephrin与podocin表达量下降为对照组的50%;PAN(50μg/ml)刺激MPC5 24h,诱导足细胞出现线粒体功能障碍,表现为细胞ROS产生增加、线粒体膜电位(JC-1)及mtDNA拷贝数降低,miR-21表达量增加。3.miR-21 mimicss瞬时转染MPC5可使miR-21表达量增加4倍。miR-21过表达诱导足细胞损伤,凋亡增加、nephrin及podocin表达量降低。同时,miR-21过表达诱导足细胞出现线粒体功能障碍,细胞ROS的产生增加、线粒体膜电位(JC-1)及mtDNA拷贝数降低。结论:miR-21参与了 PAN诱导的足细胞损伤及线粒体功能障碍。第二部分Dnm1l是miR-21的直接靶基因目的:验证Dnm1l 是miR-21的直接靶基因。方法:1.利用靶基因预测软件预测miR-21的靶基因。2.应用双萤光素酶报告基因(Dual luciferase reporter gene)鉴定 Dnm1l 是否为 miR-21 的直接靶基因。3.体外培养MPC5,分为过表达miR-21组(miR-21OE)和对照组(vehi)。4.体外培养MPC5,用转染试剂Lip2000瞬时转染含Dnm1l编码区序列的质粒,Lip2000浓度为3μl/ml,质粒浓度为1μg/ml,再过表达miR-21,分为对照组(vehi)、miR-21 过表达组(miR-21OE)及 miR-21 与 Dnm1l 共表达组(miR-21 OE+Dnm1l)。通过实时荧光定量PCR和western blot检测Drm11表达量的变化;荧光探针DCHFDA染料检测细胞ROS的产生;流式细胞术检测线粒体膜电位;应用Annexin V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;western blot检测nephrin和podocin的表达量。结果:1.多个靶基因预测软件(TargetScan、PicTar Genome、RNAHybrid)预测到Dnm1l可能是miR-21的直接靶基因,其可能的结合位点为Dnm1l基因3’UTR区的长度为7个碱基对的序列。2.双荧光素酶报告基因结果显示Dnm1l的3’UTR野生型(Dnm1lWT)与miR-21mimics共转染细胞,萤光素酶活性显著降低,而Dnm1l的3’ UTR突变型(Dnm1l MUT)与miR-21mimics共转染细胞,萤光素酶活性无明显改变。3.过表达miR-21显著抑制Dnm1l表达,Dnm1l表达量下降为对照组的30%,提示Dnm1l可能是miR-21的靶基因。4.miR-21过表达后,足细胞ROS增加4倍、JC-1降低30%，mtDNA拷贝数降低40%，nephrin表达降低40%，Dnm1l表达降低55%。共表达miR-21与Dnm1l,则可以逆转miR-21过表达引起的ROS增加、JC-1和mtDNA降低,并逆转nephrin和Dnm1l的降低,ROS降低至对照组的2倍,JC-1和mtDNA拷贝数恢复至对照组的95%,nephrin和Dnm1l表达恢复正常。结论:Dnm1l是miR-21的直接靶基因。第三部分miR-21/Dnm11信号通路在PAN诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍中的作用目的:探讨miR-21是否通过下调Dnm1l引起PAN诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍。方法:体外培养MPC5,分为对照组(vehi)、PAN刺激组(vehi+PAN)及miR-21干预组(miR-21KD+PAN)。miR-21干预组于加PAN前6小时予转染试剂siRNA mate 及 miR-21 inhibitor 共转染细胞,siRNA mate 浓度为2μLI/ml miR-21 inhibitor浓度为20nM,同时另两组予等量转染试剂及阴性对照序列(microRNA inhibitor negative control);PAN浓度为50μg/ml,不加药组予等量生理盐水。western blot检测nephrin和Dnm1l的表达量;应用Annexin V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡·;采用荧光探针DCHFDA染料检测细胞ROS的产生;流式细胞术检测线粒体膜电位;实时荧光定量PCR检测mtDNA拷贝数的变化。结果:PAN刺激后,足细胞nephrin表达量降低55%，Dnm1l表达量降低45%,凋亡增加至对照组的1.8倍,ROS上升至对照组的1.5倍,JC-1降低20%，mtDNA拷贝数减少40%。敲低miR-21后给予PAN刺激,nephrin和Dnm1l表达量恢复正常,凋亡和ROS较PAN刺激组显著降低,JC-1和mtDNA拷贝数恢复正常。结论:miR-21通过下调Dnm1l引起PAN诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍。