食管鳞癌致死率高、预后差、疗效有限。在我国,每年约有20~30万新发病例,约占全球发病的一半以上,尤其是河南林县、磁县等太行山区是我国食管癌高发地区,成为威胁我国人民生命健康的重要恶性肿瘤之一。尽管围手术期及手术期化疗、放疗等综合治疗显著提高了食管鳞癌患者的生存时间,然而,对于晚期患者而言,预后仍然很差,自然病程通常约6~8个月,5年生存率为10%~25%左右。食管鳞癌细胞侵袭、迁移至其他器官,而且食管鳞癌更容易发生经淋巴管及血管的远处转移,这成为了食管鳞癌治疗失败的重要原因。因此,研究食管鳞癌侵袭迁移的发生发展机制是国内外该领域研究的热点内容,而上皮间质转化(EMT)及间质上皮转化(MET)是包括食管鳞癌在内的多种恶性肿瘤侵袭迁移的重要调控机制之一。S100A4为钙离子结合蛋白S100蛋白家族成员,其主要参与细胞骨架及细胞膜间相互作用、钙离子信号传递、细胞生长分化等,可降低细胞间黏附力、重塑细胞外基质,并促进细胞异常增生及血管生成,从而增加肿瘤细胞侵袭迁移能力,故被称为恶性肿瘤转移相关基因。S100A4的表达水平与乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌等恶性肿瘤复发转移成正相关。然而,有关食管鳞癌中S100A4促使其侵袭迁移的具体分子机制目前仍然不明。本研究首先采用实时荧光定量PCR技术、免疫组化染色技术、Western blotting技术等检测食管鳞癌组织及配对癌旁食管黏膜组织中S100A4 m RNA和蛋白表达水平,并分析S100A4表达与临床病理学参数之间的相关性;然后利用si RNA技术敲减S100A4在食管鳞癌EC9706细胞中的表达水平,观察S100A4表达下调对EC9706细胞侵袭迁移及增殖能力的影响;进一步研究S100A4表达下调对食管癌EC9706细胞E-cadheirn、vimentin和Snail表达的影响;然后上调Snail在EC9706细胞中的表达水平,检测Snail表达水平增高对EC9706侵袭迁移及增殖能力的影响。总之,本实验以S100A4分子为靶点,探讨其在食管鳞癌侵袭迁移中的作用及其分子机制,共分为3个部分。第一部分:S100A4在食管鳞癌组织中的表达及其预后分析方法1.采用原位免疫杂交技术、免疫组化染色技术检测150例食管鳞癌组织及配对癌旁正常食管黏膜组织中S100A4 m RNA和蛋白表达水平,并分析其与临床病理学参数之间的相关性。为进一步验证,采用荧光定量PCR技术、Western blotting技术检测随机选取10例食管鳞癌癌组织和配对癌旁正常食管黏膜组织中S100A4 m RNA及蛋白表达水平。2.利用Kaplan-Meier生存曲线分析S100A4 m RNA和蛋白表达水平与食管鳞癌患者生存期之间的关系。3.所有数据均采用SPSS 12.0进行统计分析,计数资料比较采用χ2检验;生存曲线采用Kaplan-Meier方法进行分析,并采用log-rank检验比较分析;计量资料采用x±s表示,比较采用单因素方差分析和t检验,检验水准α=0.05。结果1.S100A4 m RNA、蛋白主要表达于食管鳞癌组织和配对癌旁正常食管黏膜组织的细胞质,且食管鳞癌组织中S100A4 m RNA、蛋白表达水平显著高于配对癌旁组织(P<0.05)。2.S100A4 m RNA、蛋白的表达与食管鳞癌患者的性别、年龄和肿瘤分化程度无关(P>0.05),但是与食管鳞癌患者肿瘤体积、TNM分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。3.高表达S100A4的食管鳞癌患者的生存期显著低于低表达S100A4的食管鳞癌患者。第二部分:S100A4对食管癌侵袭迁移及增殖能力的影响及其分子机制方法1.利用si RNA敲减技术使得S100A4表达下调,检测S100A4表达水平下调对食管鳞癌EC9706细胞增殖、细胞周期以及侵袭迁移能力的影响。2.利用si RNA敲减技术使得S100A4表达下调,观察对食管鳞癌EC9706细胞E-cadheirn、vimentin和Snail表达水平的影响。3.应用Gene Tools对Western blotting结果进行灰度值分析(n=3)。然后应用SPSS 12.0进行数据分析,计数资料比较采用χ2检验;生存曲线采用Kaplan-Meier方法进行分析,并采用log-rank检验比较分析。计量资料采用x±s表示,比较采用单因素方差分析和t检验,检验水准α=0.05。结果1.si RNA转染成功可下调S100A4基因在EC9706细胞中的表达水平(P<0.05)。2.S100A4表达水平下调使得食管癌EC9706细胞增殖能力显著受到抑制,S100A4下调组与对照组相比,G0/G1期细胞比例明显下降,而S期比例增高,侵袭迁移能力明显下降(P<0.05)。3.S100A4表达下调后,食管鳞癌EC9706细胞E-cadheirn表达明显下调、vimentin及Snail表达明显增加(P<0.05)。第三部分:S100A4通过调控Snail表达参与食管癌EMT过程及其分子机制方法1.将Snail正义真核表达载体pc DNA 3.1-Snail转染EC9706细胞,经G418筛选后获稳定转染细胞,共转染S100A4 si RNA,观察Snail表达水平上调对食管鳞癌EC9706细胞增殖及侵袭迁移能力的影响。2.将Snail正义真核表达载体pc DNA 3.1-Snail转染EC9706细胞,通过实时荧光定量PCR技术、Western blotting法检测E-cadheirn及vimentin的表达水平变化。3.所有数据均采用SPSS 12.0进行统计分析,计数资料比较采用χ2检验;计量资料采用x±s表示,比较采用单因素方差分析和t检验,检验水准α=0.05。结果1.Snail表达水平上调可部分逆转因S100A4 si RNA转染导致的食管鳞癌EC9706细胞EMT行为(P<0.05)。2.Snail表达水平上调可增强S100A4下调组食管鳞癌EC9706细胞的侵袭及迁移能力(P<0.05)。3.上调Snail表达水平可增强S100A4下调组食管鳞癌EC9706细胞的增殖能力(P<0.05)。结论1.检测到食管鳞癌组织和配对癌旁正常食管黏膜组织及食管鳞癌EC9706细胞系中存在着S100A4蛋白表达,S100A4表达可在食管鳞癌的发生发展及侵袭迁移中发挥重要作用,成为食管鳞癌转移和预后评估的分子标记。2.S100A4在食管鳞癌组织中的过表达可能牵涉到细胞增殖、细胞周期、细胞侵袭和迁移的调控。S100A4介导的食管鳞癌细胞的侵袭迁移有望为食管鳞癌的分子靶向治疗提供理论依据。3.S100A4通过调控Snail表达参与食管鳞癌EMT过程,进而促使食管癌侵袭迁移。