滨蒿内酯对朱砂叶螨生殖力及卵黄原蛋白Tcvg5、Tcvg6基因表达的影响研究

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朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)属于节肢动物门(Arthropoda),蛛形纲(Arachnida),真螨目(Acariformes),叶螨科(Tetranychidae),是一种世界性害螨,其寄主范围广泛,包括棉花、玉米、豆类、瓜、芝麻、红麻等,因此对该害螨的防治研究是迫切需要的。该螨具有世代周期短、繁殖力强等特性,加之目前长期使用化学农药进行防治,导致其后代抗性发展迅速,寻求新型农药进行防治的诉求十分强烈。滨蒿内酯是一种天然香豆素类化合物,广泛存在于茵陈蒿、滨蒿和佛手等多种植物中,本课题组前期研究发现其具有优良的杀螨活性,其杀螨机制未知,被期望作为一种具有新颖作用机制的化合物用于害螨控制。在农药的实际应用过程中,残留药剂会逐渐降解,由致死浓度变为亚致死浓度从而产生亚致死效应,对昆虫的行为、生长发育、生殖力产生影响。明确滨蒿内酯对朱砂叶螨的亚致死效应及其机制对于滨蒿内酯的田间实际应用具有指导意义。卵黄原蛋白(Vitellogenin,vg)是卵生动物在卵黄发生过程中发挥重要功能的一种蛋白,它对卵母细胞和卵巢的发育成熟具有十分重要的意义,理论上,朱砂叶螨的卵黄原蛋白对其生殖力的形成至关重要。因此,本研究以朱砂叶螨为研究对象,利用生命表技术,在种群水平上研究了滨蒿内酯对朱砂叶螨生殖力的亚致死效应,并从卵黄原蛋白的角度开展研究对此作出解释。旨在为其实际应用提供理论依据。主要结果如下:1.滨蒿内酯能显著抑制朱砂叶螨的生殖力,在F2代最大抑制19.00%产卵量。首先明确了滨蒿内酯48h触杀毒力,亚致死浓度LC20、LC30、LC40分别为0.021 mg/mL、0.057 mg/mL、0.134 mg/mL,利用生命表技术明确了滨蒿内酯对朱砂叶螨F1代、F2代世代历期有显著影响,并能略微缩短F0代、F1代和F2代朱砂叶螨的产卵期和雌成螨寿命,且亚致死浓度LC40对F0代和F1代雌成螨产卵量抑制程度最大,分别降低了13.82%和18.44%,LC20和LC30浓度则显著性降低了F2代雌成螨产卵量,分别降低了17.04%和19.00%。2.克隆得到了两条朱砂叶螨响应滨蒿内酯调控生殖作用的卵黄原蛋白基因Tcvg5、Tcvg6。基因全长分别为5085 bp和5247 bp,各编码1694个氨基酸和1748个氨基酸,经序列比对证实克隆得到的这两条基因都含有卵黄原蛋白基因的特征结构域Vitellogenin_N,DUF1943和VWD。不同螨态表达模式分析显示,Tcvg5、Tcvg6表达量在成虫孵化后第三天表达达到高峰期。不同药剂浓度处理各代雌成螨48 h后检测两条基因的表达量,在F0代、F1代中,Tcvg5和Tcvg6表达量随着处理浓度增大逐渐降低,在F2代中则是亚致死浓度LC30处理最大程度抑制了两条基因的表达。3.对朱砂叶螨卵黄原蛋白基因Tcvg5、Tcvg6进行了RNAi研究,结果表明卵黄原蛋白基因Tcvg5、Tcvg6参与了朱砂叶螨的产卵过程。在饲喂dsRNA后,Tcvg5、Tcvg6沉默效率分别为51.35%和63.75%。DEPC-ddH2O对照组的平均产卵量为80.93粒,dsRNA-GFP处理组的平均产卵量为72.20粒,而dsRNA-Tcvg5和dsRNA-Tcvg6两个处理的平均产卵量分别为55.43粒和51.77粒,相较于DEPC-ddH2O处理分别下降了31.51%和36.03%,且均与DEPC-ddH2O对照组存在显著性差异。本研究表明,滨蒿内酯对朱砂叶螨种群的生殖能力具有一定程度的抑制作用,亚致死浓度的滨蒿内酯能使卵黄原蛋白基因Tcvg5、Tcvg6表达量下降,且RNAi研究证实Tcvg5、Tcvg6参与了朱砂叶螨的产卵力的形成,表明滨蒿内酯影响朱砂叶螨的生殖力下降的内在分子机制是抑制了Tcvg5、Tcvg6在朱砂叶螨体内的表达。
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