YY1诱导的长链非编码RNA TUG1靶向YOD1促进多发性骨髓瘤恶性进展的机制研究

来源 :南通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:romotic
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目的检测lncRNA-TUG1在MM患者血清中的相对表达水平,研究血清TUG1对MM辅助诊断和临床诊疗监测的应用价值;体内、体外研究TUG1对MM细胞增殖、凋亡以及迁移能力的影响;探讨转录因子对TUG1的转录活性及表达水平的调控;探究TUG1在MM细胞核内发挥调控作用的具体机制。方法收集南通大学附属医院血液科确诊的MM患者标本,qRT-PCR法检测TUG1的相对表达水平,并进行方法学评价;分析TUG1表达水平与临床MM诊断指标间的相关性,ROC曲线评价其诊断价值;构建TUG1干扰慢病毒,转染MM细胞,筛选干扰效率高的片段;CCK-8法、Transwell小室实验检测TUG1对MM细胞增殖、迁移的影响;流式细胞术、Western blot检测TUG1对MM细胞周期及凋亡的影响;构建裸鼠移植瘤模型,生长曲线、免疫组化分析TUG1对肿瘤组织生长的影响;FISH和核浆分离PCR试验明确TUG1的亚细胞定位;生物信息学软件预测与TUG1启动子区域结合的转录因子,qRT-PCR相关性验证;构建YY1干扰和过表达载体转染MM细胞后检测其对TUG1表达水平的调节;双荧光素酶报告基因验证YY1对TUG1转录活性的调节;转录组测序和RNA pulldown寻找TUG1靶蛋白,qRT-PCR相关性验证;构建YOD1干扰和过表达载体,转染MM细胞,CCK-8法、Transwell小室实验检测YOD1对MM细胞增殖、迁移的影响;流式细胞术、Western blot检测YOD1对MM细胞周期及凋亡的影响;YOD1过表达载体和TUG1干扰载体共同转染MM细胞,CCK-8法、Transwell小室检测YOD1过表达对TUG1干扰MM细胞增殖、迁移的影响;流式细胞术、Western blot检测YOD1过表达对TUG1干扰MM细胞周期及凋亡的影响。结果以18S rRNA为内参,qRT-PCR方法检测TUG1具有较好的线性、重复性、特异性和稳定性;MM初诊病例组骨髓中TUG1表达水平显著高于健康对照(P<0.05);MM初诊病例组血清中TUG1表达水平显著高于健康对照者(P<0.05),治疗后显著下降(P<0.05),而复发患者又显著升高(P<0.05);MM细胞株中TUG1表达水平显著高正常浆细胞(P<0.05);血清TUG1表达量与临床诊断指标相关性分析显示,高表达的TUG1与总蛋白(P=0.035)、ALB(P=0.037)、球蛋白(P=0.035)、β2-MG(P=0.037)、骨损伤(P=0.007)显著相关;单因素和多因素分析表明,TUG1可作为MM病例DS分期的独立预测因子(P<0.05);ROC曲线示TUG1的AUC为0.792,灵敏度和特异性为65.5%和94.9%,高于 β2-MG 和 ALB。细胞功能学实验证实,TUG1干扰载体转染MM细胞后,细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),迁移能力显著下降(P<0.05),细胞出现G0/G1期阻滞,S期细胞显著减少(P<0.05),凋亡细胞显著增加(P<0.05);裸鼠移植瘤模型证实,TUG1干扰后,细胞成瘤能力显著下降,生长速率减慢;瘤组织免疫组化结果示TUG1干扰后增殖期细胞变少,凋亡期细胞显著增多。FISH和核浆分离PCR证实TUG1主要定位于MM细胞核中;生物信息学软件预测结果表明转录因子YY1可结合于TUG1的启动子区域;YY1表达量及其与TUG1表达量的相关性结果显示YY1与TUG1显著正相关(P<0.05),且在MM患者中高表达(P<0.05);构建YY1干扰和过表达载体转染MM细胞,结果证实,YY1干扰后TUG1明显下调(P<0.05),YY1过表达后TUG1显著上调(P<0.05);双荧光素酶报告基因证实YY1可促进TUG1的转录活性(P<0.05)。TUG1干扰后转录组测序、RNA pulldown和相关性分析显示YOD1是TUG1潜在的靶蛋白;体外细胞功能学实验证实,YOD1干扰载体转染MM细胞后,细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),迁移能力显著下降(P<0.05),细胞出现G0/G1期阻滞,S期细胞显著减少(P<0.05),凋亡细胞显著增加(P<0.05);YOD1过表达载体转染MM细胞后,细胞增殖速度显著加快(P<0.05),迁移能力显著升高(P<0.05),G0/G1期比例减少,S期比例显著增加(P<0.05),凋亡细胞显著减少(P<0.05);功能回复实验证实,共转YOD1过表达载体和TUG1干扰载体后,细胞增殖速度得到回复加快(P<0.05),迁移能力得到回复升高(P<0.05),周期回复后G0/G1期细胞减少,S期细胞显著增加(P<0.05),凋亡细胞显著减少(P<0.05)。结论MM初诊患者血清TUG1表达显著升高,而治疗后显著下降,提示其可能是一个潜在的MM诊断和治疗监测的临床生物标志物;受转录因子YY1调控的TUG1在MM细胞中表达升高,并靶向YOD1促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡,进一步促进MM的恶性进展。本研究提示,TUG1可能作为MM诊断的新型标志物及MM治疗的潜在靶点。
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