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研究背景:胃癌(gastric cancer)是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一。与多数的恶性肿瘤相同,胃癌细胞在持续的生长、扩散以及转移的过程中需要持续的氧气及营养物质的供应。所以,肿瘤组织需要不断地形成新生血管以满足自身生长的需求。因此,如若能够阻断肿瘤血管生成过程,则有可能在一定程度上抑制肿瘤的生长,防止肿瘤的扩散和转移。目前虽然已经有很多基于上述理论而产生的针对血管生成的靶向治疗药物,但是胃癌的抗血管生成治疗仍然局限在二线及三线治疗,因此需要对胃癌的抗血管生成治疗进行进一步的探索。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是已经发现的在肿瘤血管形成过程中作用最为显著的因子,它通过与其受体特异性结合,发挥促进血管生成的作用。目前,针对VEGF靶点的抗血管生成的靶向药物—贝伐珠单抗虽然不能延长晚期胃癌患者的总生存期,但是可以一定程度上提高总反应率及中位无进展生存期,而且亚组分析显示在非亚裔人群中有显著的生存获益。所以对针对VEGF的抗血管生成治疗的探索仍然有很高的临床应用价值。微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)是一类普遍存在于生物体内的单链非编码小分子核糖核酸,它们可以通过特异性地与靶基因的3’端非编码区结合导致靶基因的翻译受到抑制,负向调控靶基因的表达水平,从而参与了机体的很多生物学过程,其中亦包括肿瘤血管生成的过程。微囊泡(microvesicles,MVs)是一种可以由多种细胞主动分泌的小的膜性结构。它可以携带多种生物活性物质如蛋白质、m RNA及miRNA等,可以作为细胞之间信息传递及信号传导的一种新的途径。已有研究显示细胞分泌的微囊泡可以通过其包裹的miRNA分子作用于特定的靶细胞,调控靶基因的表达,进而参与细胞的增殖、分化和凋亡过程。但是有关于微囊泡及miRNA在肿瘤血管生成方面的研究较少。研究目的:本研究将探索miRNA-VEGF血管调节通路,证明此通路在胃癌血管生成中的作用,并利用微囊泡运输miRNA达到体内阻断血管生成的目的,以期为胃癌的抗血管生成靶向治疗提供新的思路和途径。研究方法:1.收集胃癌患者癌旁正常胃组织和胃癌肿瘤组织,利用Western blot技术检测不同组织中VEGF的蛋白表达水平。通过生物信息学软件miRanda、Target Scan、Pic Tar预测VEGF的潜在上游miRNA,并通过荧光素酶报告基因的方法进行验证。通过细胞转染技术改变胃癌细胞中的潜在上游miRNA的表达水平,然后通过Western blot技术及ELISA技术分别检测胃癌细胞中潜在上游miRNA对VEGF的蛋白表达和释放的调控作用。2.利用Transwell细胞非接触式共培养技术建立肿瘤微环境体外模型,模拟胃癌微环境中胃癌细胞与血管内皮细胞之间的相互作用。通过CCK-8细胞增殖实验及体外血管成环实验观察共培养的胃癌细胞对血管内皮细胞的增殖及体外成环能力的影响。3.利用电子显微镜及Western blot技术对体外分离的微囊泡的形态和表型进行鉴定;利用细胞转染技术改变微囊泡中所携带的miRNA,并用实时定量PCR技术对其所携带的miRNA的含量进行分析。之后,从体外及体内两个方面证明微囊泡可以作为运输miRNA的载体,通过特异性调节VEGF而抑制肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤的生长。研究结果:1.VEGF在胃癌的肿瘤组织中呈高水平表达;生物信息学软件预测VEGF的潜在上游miRNA结果显示miR-29a/c可以与VEGF的3’-UTR区特异性的结合;实验方法进一步证实了miR-29a/c对VEGF的直接识别及调控作用;细胞水平实验结果显示,当胃癌细胞转染了miR-29a/c mimics后,胃癌细胞中的VEGF的表达和释放水平显著下调;而当胃癌细胞转染了miR-29a/c inhibitors后,胃癌细胞中的VEGF的表达和释放水平显著上调。2.通过细胞共培养技术成功建立了肿瘤细胞生长的微环境模型,结果显示,与转染了miR-29a/c的mimics的胃癌细胞共培养的血管内皮细胞的增殖速度明显受到抑制,而与转染了miR-29a/c的inhibitors的胃癌细胞共培养的血管内皮细胞的增殖速度明显加快;与转染了miR-29a/c的mimics的胃癌细胞共培养的血管内皮细胞的成环能力受到显著抑制。3.显微镜下的形态观察及表型鉴定证实了微囊泡可以稳定存在,并证明了传统的低温超速离心法可以成功分离出HEK293T细胞所分泌的微囊泡;定量PCR结果证实了可以通过细胞转染技术对HEK293T细胞所分泌的微囊泡中的miRNA的表达量进行改变;之后利用这种人工改造后的微囊泡孵育胃癌细胞,结果显示,经过高表达miR-29a/c的HEK-293T细胞所分泌的微囊泡处理的胃癌细胞的VEGF表达和释放水平显著下降;将处理后的胃癌细胞与血管内皮细胞共培养,结果显示,与经过高表达miR-29a及miR-29c的HEK-293T细胞所分泌的微囊泡处理胃癌细胞共培养的血管内皮细胞的增殖、迁移及成环能力明显受到抑制;在成功建立了小鼠胃癌荷瘤模型后,在成瘤过程中的不同时间点对小鼠进行尾静脉注射高表达miR-29a及miR-29c的HEK-293T细胞所分泌的微囊泡,结果显示,微囊泡运输miR-29a/c能够显著抑制肿瘤组织VEGF的表达水平及肿瘤的生长。研究结论:1.Mi R-29a/c抑制胃癌细胞中VEGF的表达和释放;2.在胃癌细胞与血管内皮细胞共培养的情况下,胃癌中过表达miR-29a/c可以显著抑制血管内皮细胞的增殖及成环能力;3.微囊泡可以作为运输miR-29a/c的载体,通过靶向抑制胃癌细胞VEGF的表达和释放,抑制血管内皮细胞的增殖和成环,从而达到抑制肿瘤生长的目的。