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研究背景哺乳动物中枢神经系统损伤后缺乏再生能力,而两栖类动物和硬骨鱼却具有神奇的完全再生能力。热门的新型动物模型一斑马鱼,在整个生命过程中中枢神经系统具有完全再生能力。这些再生潜能的分子机制到底的是什么,目前并不清楚。对斑马鱼神经损伤后再生能力的研究,将为哺乳动物,特别是人类的神经再生潜能研究,提供一个很好的指导方向。在神经系统发育过程中,新生神经元的细胞骨架发生广泛的、动态性的改造进而促进神经形成有序进行以及细胞迁移和终端分化。GMFB基因高度保守,曾参与了胶质细胞缺氧损伤后的再生修复,是ADF/Cofilin超家族的一员,该家族主要参与F-actin细胞骨架的重塑。本实验室前期的研究发现,成年斑马鱼端脑损伤后GMFB表达升高。因此,有理由推测,GMFB在成年斑马鱼端脑神经损伤后的再生过程中发挥重要作用。本课题采用斑马鱼模型,研究了 GMFB在神经损伤后的作用,并对其机制做了初步探讨。一、研究目的斑马鱼GMFB基因敲除模型,研究GMFB对成年斑马鱼端脑神经损伤后再生的影响,放射状胶质细胞形态、增殖分化的影响,以及这些变化对斑马鱼整体功能的影响,以明确GMFB在大脑发育和再生中的功能。二、实验方法1.斑马鱼的饲养和针刺损伤成年斑马鱼饲养在标准的环境:28.5℃,14h light/10hdark光照周期。选择6-12个月的成年斑马鱼进行针刺损伤。2.在斑马鱼上用CRISPR-Cas9技术敲除gmfb基因选择AB野生型斑马鱼卵单细胞期显微注射sgRNA和Cas9 mRNA溶液。经过DNA、mRNA、蛋白水平验证和筛选出稳定遗传的gmfb基因缺陷模型。3.限制性内切酶消化反应选取斑马鱼胚胎或剪取斑马鱼尾巴组织裂解离心,进行PCR。产物核酸电泳检测,筛选出纯合子。4.整胚原位杂交实验提取斑马鱼胚胎整个cDNA扩增探针引物序列。酶消化后PCR产物在pBluescriptSK(+)菌中克隆。用地高辛-UTP合成探针去检测gmfb的mRNA,用NBT/BCIP酶作用物染色显示。5.组织准备和免疫荧光染色用胰岛素针在成年斑马鱼端脑制造损伤,取损伤后不同时间脑组织。4%PFA固定、脱水、包埋后进行切片、抗原修复和荧光染色。6.斑马鱼幼鱼自发行为观察观察记录幼鱼的行为并转化为可视图和输出总的移动距离,平均速度和其他运动参数。7.数据分析实验数据统计学分析采用SPSS 19统计软件进行。结果以均数±标准差表示,结果用单因素方差分析(One-way ANOVA法)或者独立样本t检验。P<0.05,差异具有统计学意义。三、实验结果1.GMFB在胚胎和成年的斑马鱼的表达情况GMFB在斑马鱼胚胎3hpf(hours post fertilization)开始表达,且逐渐集中在脑部。GMFB在成年斑马鱼端脑的脑室区,特别是端脑背侧中缝、背侧脑室区和皮质的背侧区表达。皮质下区的脑室区未见GMFB的表达。2.GMFB在脑损伤侧的背侧脑室区表达上调观察损伤后GMFB的时空表达情况。结果发现损伤1天后GMFB的表达轻度升高,损伤3天后GMFB明显升高。3.敲除GMFB影响端脑损伤再生过程正常情况下,GMFB敲除组斑马鱼端脑放射状胶质细胞(radial glial cells,RGCs)的数量与野生型组相比无明显差异,但敲除组的GFAP纤维数量减少,变短,而且排列紊乱。针刺损伤后,尽管GFAP略有增生,但相比野生型组,这种差别更为显著。两组的损伤侧RGCs的数量明显升高,但敲除组的升高程度比野生型组的低,敲除组伤口愈合的时间要更长。这些结果提示GMFB对端脑损伤再生修复过程中RGCs的数量和形态的维持是十分重要的。4.敲除GMFB抑制了端脑再生中放射状胶质细胞(radial glial cells,RGCs)的Ⅰ型向Ⅱ型的分化采用放射状胶质细胞的细胞类型标志,即Ⅰ型细胞(沉默型)为GFAP+PCNA-,Ⅱ型(分化前型或增殖型)为GFAP+PCNA+;Ⅲ型(分化型)为GFAP-PCNA+;我们发现无损伤情况下,野生型组和敲除组的端脑中缝区的Ⅰ型、Ⅱ型RGCs数量无显著差异。但在针刺损伤后,同野生组相比,GMFB的敲除抑制了放射状神经胶质细胞Ⅰ型细胞向Ⅱ型细胞的转化,表现为Ⅰ型细胞数量(GFAP+PCNA-)的增加,而Ⅱ型细胞(GFAP-PCNA+)数量的降低,相对于细胞的增殖,GMFB更多影响了神经干细胞的分化,而干细胞的分化是神经再生中非常重要的一步,也是哺乳动物中枢神经无法完全再生的关键之一,我们的结果提示在维持斑马鱼的神经再生的分子机制中,GMFB是必不可少的。5.抑制Arp2/3复合体可以改善gmfb敲除组幼鱼的GFAP纤维分叉GMFB敲除组幼鱼的GFAP纤维丝分叉增多。抑制Arp2/3复合体后改善了GFAP纤维分叉。6.敲除gmfb后对斑马鱼行为的影响统计分析每尾幼鱼的总运动距离,平均速度提示敲除GMFB的幼鱼的运动距离和运动速度均要低于野生型组,提示敲除GMFB后减弱了幼鱼的运动能力。四、结论本研究提出一个观点:成年斑马鱼端脑损伤后GMFB参与损伤后神经再生过程,推测其在哺乳动物中可能有类似作用。