细胞凋亡是卵细胞和胚胎细胞死亡的主要方式,也是导致卵细胞受精障碍、胚胎发育停滞和体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)失败的主要原因。细胞凋亡的分子调控机制十分复杂,至今仍未完全明确。目前的研究认为,抗凋亡分子和促凋亡分子在调节胚胎发育和胚胎细胞凋亡方面起着关键性的作用,它们之间的平衡决定细胞的生存或凋亡。其中,Bcl-2家族和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease, Caspase)家族是早期胚胎中表达的两大主要细胞凋亡调控基因,具有相当重要的意义。而抗凋亡人工干预胚胎措施有可能是一条促进早期胚胎发育、提高胚胎质量和IVF成功率的新途径。因此,本研究拟以小鼠早期胚胎为实验对象,在体外胚胎培养基中加入以阻断细胞凋亡转导途径为主的1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate, S1P)、Caspase广谱抑制剂(broad-spectrum Caspase inhibitor, CAI),和以提供细胞增殖信号为主的干细胞因子(stem cell factor, SCF),分析这几种抗凋亡因子对体外胚胎早期发育的影响及其有效浓度,以及进一步探讨其对C2-神经酰胺(C2-ceramide, CED)或过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)诱导胚胎细胞凋亡的抑制作用,从而为将来建立一种高效稳定安全的多因素协同抗凋亡干预促胚胎发育技术并最终将其应用于IVF-ET临床治疗提供一定的理论和实验依据。第一部分小鼠早期胚胎质量与凋亡的关系【目的】通过分析小鼠早期胚胎质量与细胞凋亡的关系,了解细胞凋亡调控基因在早期胚胎发育中所起的重要作用,旨在为提高胚胎质量寻找一条新途径。【方法】采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)检测、Caspase原位荧光检测和Bcl-2免疫荧光检测等凋亡检测技术,以及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)免疫荧光检测细胞增殖程度的技术,分别对小鼠早期形态正常的胚胎、早期发育阻滞的胚胎和有碎片的胚胎进行细胞凋亡程度和增殖程度的检测,比较其凋亡和增殖程度的差异。【结果】1、小鼠早期发育阻滞的胚胎细胞和胚胎中的碎片TUNEL荧光呈阳性。2、小鼠早期发育阻滞的胚胎细胞和胚胎中的碎片Caspase荧光增强。3、小鼠早期发育阻滞的胚胎细胞和胚胎中的碎片Bcl-2、PCNA荧光减弱。【小结】小鼠早期发育阻滞的胚胎细胞和胚胎中的碎片均发生DNA断裂,Caspase活性均增强,Bcl-2、PCNA表达水平均降低。这表明,细胞凋亡与胚胎发育阻滞及胚胎中的碎片形成密切相关。第二部分1-磷酸鞘氨醇、Caspase广谱抑制剂和干细胞因子对小鼠早期胚胎发育的作用【目的】分析抗凋亡因子S1P、CAI和SCF对体外鼠胚早期发育的影响及其有效浓度,为抗凋亡干预改善胚胎质量并将其应用于IVF-ET临床治疗提供一定的实验依据。【方法】1、将小鼠经超促排卵后合笼交配所获得的受精卵体外培养96h,跟踪观察胚胎细胞增殖数目及细胞形态,计算各组囊胚形成率、2-4细胞期阻滞胚胎率、有碎片的胚胎率。2、S1P实验按不同浓度梯度分组：设置空白对照组(BC组)、阴性对照组(NC组)、S1P100nM组、S1P50nM组、S1P25nM组、S1P12.5nM组。3、CAI实验按不同浓度梯度分组：设置BC组、NC组、CAI20μM组、CAI10μM组、CAI5μM组、CAI2.5μM组。4、SCF实验按不同浓度梯度分组：设置BC组、NC组、SCF200ng/ml组、SCF100ng/ml组、SCF50ng/ml组。【结果】1、S1P实验：(1)囊胚形成率：BC组71.6％,NC组68.6％,S1P100nM组62.5%, S1P50nM组75.0%,S1P25nM组92.3%,S1P12.5nM组72.6%。S1P25nM组显著高于NC组和BC组,差异有统计学意义(P<0.001和P<0.01)；S1P其它浓度组与NC组和BC组比较,无显著性差异(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。(2)2-4细胞期阻滞胚胎率：BC组24.7%,NC组25.7%,S1P100nM组27.8%,S1P50nM组20.8%,S1P25nM组7.7%,S1P12.5nM组26.0%。S1P25nM组显著低于NC组和BC组,差异有统计学意义(P值均<0.01)；S1P其它浓度组与NC组和BC组比较,无显著性差异(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。(3)有碎片的胚胎率：BC组22.2%,NC组25.7%,S1P100nM组30.6%,S1P50nM组19.4%,S1P25nM组7.7%,S1P12.5nM组21.9%。S1P25nM组显著低于NC组和BC组,差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05)；S1P其它浓度组与NC组和BC组比较,无显著性差异(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。2、CAI实验：(1)囊胚形成率：BC组71.8％、NC组68.9％、CAI20μM组35.5%、CAI10μM组76.2%、CAI5μM组86.9%、CAI2.5μM组71.4%。CAI5μM组显著高于NC组和BC组,差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05)；CAI20μM组显著低于NC组和BC组,差异有统计学意义(P值均<0.001)；CAI其它浓度组与NC组和BC组比较,无显著性差异(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。(2)2-4细胞期阻滞胚胎率：BC组25.4%、NC组29.7%、CAI20μM组54.8％、CAI10μM组20.2%、CAI5μM组13.1%、CAI2.5μM组28.6%。CAI5μM组显著低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)；CAI5μM组低于BC组,但差异无统计学意义(P=0.051)；CAI20μM组显著高于NC组和BC组,差异有统计学意义(P值均<0.01)；CAI其它浓度组与NC组和BC组比较,无显著性差异(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。(3)有碎片的胚胎率：BC组22.5%、NC组25.7%、CAI20μM组41.9%、CAI10μM组23.8%、CAI5μM组10.7%、CAI2.5μM组22.9%。CAI5μM组显著低于NC组和BC组,差异有统计学意义(P值均<0.05)；CAI20μM组显著高于NC组和BC组,差异有统计学意义(P值均<0.05)；CAI其它浓度组与NC组和BC组比较,无显著性差异(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。3、SCF实验：(1)囊胚形成率：BC组71.2%,NC组69.6%,SCF200ng/ml组62.5%,SCF100ng/ml组77.8%,SCF50ng/ml组77.8%。SCF100ng/ml组和SCF50ng/ml组均高于NC组和BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；SCF200ng/ml组低于NC组和BC组,但差异无统计学意义(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。(2)2-4细胞期阻滞胚胎率：BC组25.8%,NC组28.6%,SCF200ng/ml组29.2 %, SCF100ng/ml组20.6%,SCF50ng/ml组20.4%。SCF100ng/ml组和3CF50ng/ml组均低于NC组和BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；SCF200ng/ml组高于NC组和BC组,但差异无统计学意义(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。(3)有碎片的胚胎率：BC组22.7%,NC组25.0%,SCF200ng/ml组26.4%,SCF100ng/ml组22.2%,SCF50ng/ml组18.5％。SCF100ng/ml组和SCF50ng/ml组均低于NC组和BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；SCF200ng/ml组高于NC组和BC组,但差异无统计学意义(P>0.05)；NC组与BC组比较,无显著性差异(P>0.05)。【小结】1、S1P、CAI在一定浓度条件下可抑制鼠胚的凋亡,从而促进鼠胚早期发育。2、SCF在抑制鼠胚凋亡和促进鼠胚早期发育方面作用不明显。第三部分1-磷酸鞘氨醇、Caspase广谱抑制剂对神经酰胺诱导的早期鼠胚凋亡的影响【目的】通过分析抗凋亡因子S1P和CAI对C2-神经酰胺(CED)诱导的早期鼠胚凋亡的抑制作用,旨在初步探讨抗凋亡因子在抑制早期胚胎凋亡和促进早期胚胎发育中的具体作用机制。【方法】1、将小鼠经超促排卵后合笼交配所获得的受精卵体外培养96h,跟踪观察胚胎细胞增殖数目及细胞形态,计算各组囊胚形成率、2-4细胞期阻滞胚胎率有碎片的胚胎率。2、实验分组：设置BC组、CED组、CED+S1P50nM组、CED+S1P25nM组、CED+S1P12.5nM组、CED+CAI10μM组、CED+CAI5μM组。【结果】1、囊胚形成率：BC组71.3％,CED组32.9%,CED+S1P50nM组42.7%,CED+S1P25nM组60.5%,CED+S1P12.5nM组51.4%,CED+CAI10μM组32.5％,CED+CAI5μM组44.2%。CED组显著低于BC组,差异有统计学意义(P<0.001)。CED+S1P25nM组、CED+S1P12.5nM组均显著高于CED组,差异均有统计学意义(P<0.001和P<0.05);CED+S1P50nM组、CED+CAI5μM组均高于CED组,但差异均无统计学意义(P>0.05);CED+CAI10μM组与CED组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CED+S1P25nM组低于BC组,但差异无统计学意义(P>0.05);CED+S1P12.5nM组、CED+S1P50nM组、CED+ CAI5μM组和CED+CAI10μM组均显著低于BC组,差异均有统计学意义(P值均<0.01)。2、2-4细胞期阻滞胚胎率：BC组25.3%,CED组55.7%,CED+S1P50nM组46.7%,CED+S1P25nM组32.6%,CED+S1P12.5nM组40.5％,CED+ CAI10μM组43.8％,CED+CAI5μM组37.7％。CED组显著高于BC组,差异有统计学意义(P<0.001)。CED+S1P25nM组、CED+CAI5μM组均显著低于CED组,差异均有统计学意义(P<0.01和P<0.05)；CED+S1P12.5nM组、CED +S1P50nM组和CED+CAI10μM组均低于CED组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。CED+S1P25nM组、CED+CAI5μM组均高于BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05);CED+S1P12.5nM组、CED+S1P50nM组和CED+ CAI10μM组均显著高于BC组,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。3、有碎片的胚胎率：BC组21.8%,CED组50.6%,CED+S1P50nM组44.0％,CED+S1P25nM组29.1%,CED+S1P12.5nM组35.1％,CED+CAI10μM组51.3%,CED+CAI5μM组45.5%。CED组显著高于BC组,差异有统计学意义(P<0.001)。CED+S1P25nM组显著低于CED组,差异有统计学意义(P<0.01);CED+S1P12.5nM组、CED+S1P50nM组和CED+CAI5μM组均低于CED组,但差异均无统计学意义(P>0.05);CED+CAI10μM组与CED组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CED+S1P25nM组、CED+S1P12.5nM组均高于BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05):CED+S1P50nM组、CED+ CAI5μM组和CED+CAI10μM组均显著高于BC组,差异均有统计学意义(P值均<0.01)。【小结】1、CED可诱导小鼠早期胚胎细胞的凋亡2、S1P可抑制CED诱导的小鼠早期胚胎细胞凋亡。3、CAI可抑制CED诱导的小鼠早期胚胎细胞凋亡。第四部分1-磷酸鞘氨醇、Caspase广谱抑制剂对H2O2诱导的早期鼠胚凋亡的影响【目的】通过分析抗凋亡因子S1P、CAI对H2O2诱导的胚胎细胞凋亡的抑制作用,来初步探讨抗凋亡因子是否能保护早期胚胎细胞免受氧化应激的影响。【方法】1、将小鼠经超促排卵后合笼交配所获得的受精卵体外培养96h,跟踪观察胚胎细胞增殖数目及细胞形态,计算各组囊胚形成率、2-4细胞期阻滞胚胎率、有碎片的胚胎率。2、实验分组：设置BC组、H2O2组、H2O2+S1P50nM组、H2O2+S1P25nM组、H2O2+CAI10μM组、H2O2+CAI5μM组。【结果】1、囊胚形成率：BC组72.1％,H2O2组31.0%,H2O2+S1P50nM组32.6%,H2O2+S1P25nM组51.1%,H2O2+CAI10μM组38.5%,H2O2+CAI5μM组50.0%。H2O2组显著低于BC组,差异有统计学意义(P<0.001)。H202+S1P25nM组、H2O2+S1P50nM组、H2O2+CAI5μM组和H2O2+CAI10μM组均高于H2O2组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。H2O2+S1P25nM组、H2O2+S1P50nM组、H2O2 +CAI5μM组和H2O2+CAI10μM组均显著低于BC组,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。2、2-4细胞期阻滞胚胎率：BC组25.6%,H2O2组59.5％,H2O2+S1P50nM组51.2%,H2O2+S1P25nM组31.1%,H2O2+CAI10μM组56.4%,H2O2+CAI5μM组44.7%。H2O2组显著高于BC组,差异有统计学意义(P<0.01)。H2O2+S1P25nM组显著低于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.01)；H2O2+S1P50nM组、H2O2+CAI5μM组和H202+CAI10μM组均低于H2O2组,但差异均无统计学意义(P>0.05).H2O2+S1P25nM组、H2O2+CAI5μM组均高于BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；H2O2+S1P50nM组、H2O2+CAI10μM组均显著高于BC组,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。3、有碎片的胚胎率：BC组23.3％,H2O2组52.4%,H2O2+S1P50nM组55.8%,H2O2+S1P25nM组33.3%,H2O2+CAI10μM组53.8%,H2O2+CAI5μM组31.6%。H2O2组显著高于BC组,差异有统计学意义(P<0.01)。H2O2+S1P25nM组、H2O2+CAI5μM组均低于H2O2组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；H2O2+S1P50nM组、H2O2+CAI10μM组与H2O2组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).H2O2+S1P25nM组、H2O2+CAI5μM组均高于BC组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；H2O2+S1P50nM组、H2O2+CAI10μM组均显著高于BC组,差异均有统计学意义(P值均<0.01)。【小结】1、H2O2可诱导小鼠早期胚胎细胞的凋亡。2、S1P可抑制H2O2诱导的早期鼠胚凋亡3、CAI对抑制H2O2诱导的早期鼠胚凋亡作用不明显。