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目的探究miR-608在前列腺癌中的功能并揭示相关的作用机制。方法(1)采用miRNA加尾法qRT-PCR测定miR-608在前列腺癌细胞系DU145和PC3以及前列腺正常细胞系RWPE-1中的表达量。采用前列腺癌组织芯片miR-608显色原位杂交的方法分析miR-608在前列腺癌组织和配对的癌旁组织中的表达情况。(2)采用BSP甲基化测序手段评估前列腺癌细胞中miR-608基因转录起始位点处的 CpG岛的甲基化状态。进一步,采用 5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine)DNA甲基化酶抑制剂处理前列腺癌细胞,并测定处理前后前列腺癌细胞系中miR-608的表达量。(3)Lipofectamine 2000用于在前列腺细胞系中转染miR-608 mimic。采用CCK8法细胞活性测定、细胞集落形成实验、流式细胞仪细胞周期测定、流式细胞仪细胞凋亡和活性caspase-3测定、细胞划痕愈合实验和Transwell细胞迁移实验研究miR-608在前列腺癌细胞系DU 145和PC3中的功能。另外,瘤内注射miR-608/NC mimic的PC3细胞裸鼠皮下成瘤实验被用于研究miR-608在体内环境中对前列腺癌的作用。(4)采用核酸qRT-PCR分析、蛋白western blot分析、以及双荧光素酶报告基因实验确定miR-608在前列腺癌中的靶基因。使用靶基因siRNA和miR-608 inhibitor的细胞功能学实验和拯救实验被用于进一步确认miR-608在前列腺癌中的作用靶点。除此之外,采用前列腺癌组织芯片免疫组化染色的方法分析miR-608的靶蛋白在前列腺癌组织和配对的癌旁组织中的表达情况。结果(1)MiR-608在前列腺癌细胞和组织中,相对于前列腺正常细胞和组织呈现低表达。MiR-608在前列腺癌PC3细胞系中的低表达与其基因转录起始位点处的CpG岛的甲基化有关。(2)在前列腺癌细胞中过表达miR-608可以抑制体内环境中PC3细胞裸鼠皮下成瘤的生长,也可以抑制前列腺癌细胞增殖,诱发前列腺癌细胞G2/M周期阻滞并抑制前列腺癌细胞迁移,其迁移抑制作用不依赖于上皮-间质转化的相关机制。RAC2 GTP酶既往被认为特异性地表达于血液系统的细胞和组织,然而本研究课题首次在前列腺癌细胞和组织中检测到RAC2蛋白的表达,并明确了 RAC2蛋白在前列腺癌中具有重要的促癌作用。RAC2被确定为miR-608的靶基因,其通过RAC2/PAK4/LIMKl/cofilin信号通路介导了 miR-608在前列腺癌中的作用。MiR-608 也可以通过靶向 BCL2L1 的 3 ’ 端非翻译区(3 ’-untranslated region,3 ’-UTR),调节BCL2L1/caspase-3信号通路从而促进前列腺癌细胞凋亡。(3)MiR-608靶向RAC2下游效应蛋白PAK4的基因编码区,而非传统的3’端非翻译区。(4)在前列腺癌细胞中利用siRNA敲低RAC2、PAK4或BCL2L1,能够重现过表达miR-608在前列腺癌细胞中的细胞增殖抑制、细胞G2/M周期阻滞、细胞迁移抑制和细胞凋亡增加的效应,其效应可以通过利用miR-608 inhibitor下调miR-608被部分抵消。RAC2和BCL2L1在前列腺癌组织中相对于癌旁组织呈现高表达,这说明RAC2和BCL2L1在前列腺癌中具有潜在的诊断价值。结论MiR-608在前列腺癌细胞和组织中呈现低表达,在前列腺癌中具有抑癌作用。其通过靶向RAC2和BCL2L1的3’端非翻译区以及PAK4的基因编码区,抑制前列腺癌细胞增殖,诱发前列腺癌细胞G2/M周期阻滞并抑制前列腺癌细胞迁移。MiR-608 在前列腺癌中的抑癌作用依赖于RAC2/PAK4/LIMKl/cofilin和BCL2L1/caspase-3 信号通路。