塑化剂主要是指邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic acid esters,PAEs),又称酞酸酯类,能增加女性患乳腺癌的概率、影响男子的生殖能力、引起儿童性早熟、危害儿童的肝脏和肾脏等,进而威胁人体健康。目前,检测PAEs的方法主要有色谱分析法、色谱质谱联用分析法、荧光分析法、分光光度法等,但这些方法要求样品高纯度、所需检测成本偏高、检测批量样品耗时长,上述方法无法实现对批量样品进行快速高通量的现场检测分析。然而,免疫分析检测方法比仪器检测方法操作简单,具有高灵敏、高特异性等优点。因此,本文旨在研究建立高效快速、高灵敏、高通量的新型免疫分析方法检测各类介质样品中的PAEs,以满足对痕量PAEs的检测需求。主要研究结果如下:(1)本论文研究选择在全球范围内常用且关注度较高的邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)为PAEs的代表物质,通过末端修饰氨基改造其分子结构从而制备半抗原,经熔点测试、紫外光谱(UV)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振氢谱(NMR)等方法表征验证了其分子结构。以牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)为载体蛋白,采用重氮化法和戊二醛法将半抗原分别偶联到载体蛋白BSA、OVA表面,制备了四种人工免疫原(BSA-DMP、BSA-DEP、BSA-DBP、BSA-DEHP)和四种人工包被原(OVA-DMP、OVA-DEP、OVA-DBP、OVA-DEHP)。然后,人工免疫原与适当佐剂充分乳化后免疫38日龄的雄性新西兰大白兔,经过为期3.5月的免疫后,从兔血清中分离获得了4种分别抗DMP、抗DEP、抗DBP和抗DEHP的多克隆抗体,所得的抗体特异性较好(交叉反应率<10%),效价均高达到110000倍以上。(2)以生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(BNHS)为生物素衍生试剂标记抗DMP、抗DEP、抗DBP和抗DEHP的多克隆抗体,并利用生物素-亲和素信号放大系统和酶联免疫吸附技术(ELISA)相结合,经过优化结合条件,分别建立了检测DMP、DEP、DBP和DEHP的间接竞争生物素-亲和素-酶联免疫吸附法(BA-ELISA)。在最佳条件下,检测DMP的线性范围为0.024-6.027μg/L,灵敏度为0.356μg/L,检测下限为0.0082μg/L;检测DEP的线性范围为0.021-9.512μg/L,灵敏度为0.443μg/L,检测下限为0.0079μg/L;检测DBP的线性范围为0.015-8.895μg/L,灵敏度为0.361μg/L,检测下限为0.0053μg/L;检测DEHP的线性范围为0.021-12.948μg/L,灵敏度为0.526μg/L,检测下限为0.0074μg/L。上述检测方法板内和板间变异系数均小于12%,表明该方法重复性较好,且方法的灵敏度比传统ELISA方法提高了5-8倍。采用该方法检测三种不同介质样品中DMP、DEP、DBP和DEHP的含量,检测结果与气相色谱-质谱法(GC-MS)相一致;样品加标回收率分别为88.1%-109%(DMP)、93.5%-108%(DEP)、89.5%-110%(DBP)、90.7%-111%(DEHP),变异系数分别为5.69%-10.3%(DMP)、5.49%-11.5%(DEP)、5.68%-11.9%(DBP)、6.64%-11.1%(DEHP)。(3)以BNHS为生物素衍生试剂标记DNA片段制备生物素化DNA,并利用生物素-亲和素信号放大系统和实时荧光定量免疫PCR技术(rt-IPCR)方法相结合,优化了各所需检测试剂的浓度,分析了基质效应的影响,分别建立了检测DMP、DEP、DBP和DEHP的直接竞争生物素-亲和素-实时荧光定量免疫PCR方法(BA-rt-IPCR)。通过扩增103 bp的目的DNA来间接实现对抗原抗体识别反应的信号检测。在最优条件下,检测DMP的浓度范围为10 pg/L-100 ng/L时线性关系良好,R~2=0.9846,检测下限为1.98 pg/L;当DEP浓度为10 pg/L-100 ng/L时线性关系良好,R~2=0.9716,检测下限为4.85 pg/L;当DBP浓度为10 pg/L-50ng/L时线性关系良好,R~2=0.9650,检测下限为2.27 pg/L;当DEHP浓度为10pg/L-50 ng/L时线性关系良好,R~2=0.9751,检测下限为2.05 pg/L;上述检测方法的板内、板间变异系数均小于15%,表明该方法稳定性较好。采用该BA-rt-IPCR方法检测三种不同介质样品中DMP、DEP、DBP和DEHP的含量;检测结果与GC-MS一致。样品加标回收率分别为91.8%-106%(DMP)、89.5%-108%(DEP)、91.3%-109%(DBP)、89.4%-110%(DEHP),变异系数分别为5.56%-11.8%(DMP)、5.69%-12.7%(DEP)、5.78%-13.2%(DBP)、4.87%-12.5%(DEHP)。此外,与间接竞争BA-ELISA方法相比,该方法的检测下限降低了近1500-4000倍不等。(4)利用还原柠檬酸钠法制备了粒径为15 nm的金纳米颗粒(GNPs),将抗DMP、抗DEP、抗DBP和抗DEHP的多克隆抗体分别和巯基修饰DNA标记在GNPs表面,成功制备了条形码DNA-金纳米-抗体复合物探针(Barcode DNA-GNPs-pAb)。再采用生物条形码技术(Bio-barcode)技术与rt-IPCR技术相结合,经过优化引物浓度、退火温度、Barcode DNA-GNPs-pAb与人工包被原的浓度比、封闭液的封闭效果以及不同基质的基质效应等因素后,分别建立了检测DMP、DEP、DBP和DEHP的直接竞争GNP-rt-IPCR分析方法。以条形码DNA(Barcode DNA)的扩增来间接实现对抗原抗体识别反应的信号检测。在最优条件下,当DMP浓度为5 pg/L-50000 pg/L时线性关系良好,R~2=0.9807,检测下限为1.38 pg/L;当DEP浓度为4 pg/L-40000 pg/L时线性关系良好,R~2=0.9756,检测下限为1.06 pg/L;当DBP浓度为5 pg/L-5000 pg/L时线性关系良好,R~2=0.9709,检测下限为1.23 pg/L;当DEHP浓度为6 pg/L-6000 pg/L时线性关系良好,R~2=0.9662,检测下限为1.57 pg/L;上述检测方法的板内、板间变异系数均小于10%,表明该方法具有较好的稳定性和可重复性。采用该GNP-rt-IPCR分析方法检测三种不同介质样品中DMP、DEP、DBP和DEHP的含量,检测结果与GC-MS相一致;应用该方法高通量检测15个实际样品,检测周期为4.5 h,远小于GC-MS方法的检测周期(75 h);此外,该方法的样品预处理方法简单,正常萃取后不需要预浓缩甚至样品的纯化,可以省去每个样品的长达30 min的预浓缩时间。该方法检测DMP、DEP、DBP和DEHP的样品加标回收率分别为89.8%-109%(DMP)、88.8%-111%(DEP)、90.1%-109%(DBP)、87.9%-109%(DEHP),变异系数分别为5.65%-12.9%(DMP)、4.89%-12.3%(DEP)、4.26%-11.6%(DBP)、4.96%-13.1%(DEHP)。与直接竞争BA-rt-IPCR分析方法相比,直接竞争GNP-rt-IPCR分析方法的检测下限降低了0.5-4倍。建立的三种新型免疫分析方法均具有高效快速、高灵敏、高特异性、操作简便快捷、高重复稳定性等优点。检测三种不同介质的实际样品分析时,检测结果与GC-MS方法基本一致,表明建立的新型免疫分析方法可用于不同介质的实际样品中DMP、DEP、DBP和DEHP的定量分析,对于实时监控各介质中DMP、DEP、DBP和DEHP的含量具有良好的应用前景。