论文部分内容阅读
棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)属鳞翅目夜蛾科实夜蛾亚科棉铃虫属，分布于北纬50°至南纬50°的广大地区，是棉花上的重要害虫，其发生与危害严重影响着棉花的产量。长期以来，棉铃虫的控制一直以化学防治为主，导致棉铃虫对各种化学药剂尤其是对拟除虫菊酯类药剂产生了严重的抗性。大量的研究表明，P450基因过量表达导致的氧化解毒能力增强是棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗性的重要机制。本研究在前人研究的基础上对棉铃虫P450基因与抗药性的关系做了进一步的研究，现将全文总结如下：一、棉铃虫细胞色素P450基因的克隆和序列分析采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫抗性品系YS-FP中克隆到两个新的细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1569bp，编码523个氨基酸；CYP9A18的cDNA编码区长1590bp，编码530个氨基酸。两个P450基因氨基酸序列都含有P450蛋白的保守结构域，如血红素结合区FXXGXRXCXG；螺旋K的结构保守特征序列EXXR；氨基酸N端开始的大约15-20个由疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域。氨基酸序列相似性分析表明，CYP6AE12与结网毛虫Depressaria pastinacella的CYP6AE1的氨基酸序列相似性为55％，CYP9A18与棉铃虫的9家族基因(CYP9A12、CYP9A14、CYP9A17v2)氨基酸序列相似性在49％-66％之间。系统进化树分析表明昆虫细胞色素P450基因的6和9家族与哺乳动物细胞色素P450的3家族处于同一进化分枝上。二、棉铃虫细胞色素P450基因抗性品系和敏感品系表达量的比较以EF-1a为参照基因，采用荧光定量PCR技术比较了6个棉铃虫P450基因在相对敏感品系YS、抗性品系YS-FP(对氰戊菊酯的抗性＞2000倍)和YS-FM(对氰戊菊酯的抗性约为350倍)中的表达量。在抗性品系YS-FP中肠中CYP6AE12有3.6倍的过量表达，CYP9A12有133倍的过量表达，其他基因无过量表达(相对于YS品系)。在YS-FP脂肪体中，CYP6AE12、CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2分别有1.3、81.4、2和3.3倍的过量表达，其他基因未发现过量表达(相对于YS品系)。在YS-FM品系中，6个基因都没有过量表达。因此，CYP6AE12、CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2的过量表达可能参与了棉铃虫YS-FP品系对拟除虫菊酯抗性的形成。从各个基因在不同组织的表达水平来看，CYP9A14、CYP9A17v2和CYP9A18在中肠中的表达量较高，而CYP6AE12、CYP687和CYP9A12在脂肪体中的表达量较高。三、棉铃虫细胞色素P450基因的功能表达细胞色素P450基因的过量表达是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗性的主要抗性机理。本研究以pYES2作为表达载体，在酿酒酵母W(R)菌株中表达了CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2基因，分析了这三个基因的异源表达产物对模式底物的氧化代谢作用(PNOD，ECOD、MCOD和MROD)及对顺式氰戊菊酯的离体代谢作用。结果表明含CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2基因的重组酵母细胞提取液的MROD活性分别是2.98、5.41、和2.80 pmol resorufin／min／mg protein，PNOD活性分别为0.59、0.42和0.47 nmol p-nitrophenol／min／mg protein；而均检测不到MCOD和ECOD活性。离体代谢顺式氰戊菊酯实验结果表明含有CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2外源基因的重组酵母细胞提取液对顺式氰戊菊酯具有代谢作用，代谢率分别为8.18、4.29和1.71pmol esfenvalerate／min／mg protein。该结果充分证实了这3个P450基因的过量表达能导致棉铃虫对拟除虫菊酯解毒能力的增强。