论文部分内容阅读
川崎病(Kawasaki disease,KD)是好发于儿童的急性全身性中、小血管炎性综合征。主要影响中小动脉,特别是冠状动脉,以免疫系统活化和血管内皮系统广泛性损害为特征。虽病因未名,但已有研究表明免疫系统异常活化及调控异常参与KD的发病机制。本文第一部分,利用目标区域捕获及二代测序技术重点关注免疫炎症相关基因在KD患儿中的异常突变。第二部分通过细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分析KD免疫调节相关易感基因表达差异情况。第一部分:靶向捕获测序技术检测川崎病免疫相关易感基因研究目的:通过靶向捕获测序技术检测川崎病免疫相关易感基因,为进一步研究川崎病的发病机制提供依据。研究方法:根据纳入标准选择2015年11月至2017年3月在上海市儿童医院就诊的199名KD患儿和99名门诊健康查体的儿童作为研究对象。选取既往报道的472个与KD易感性相关的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)以及512个与T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子受体相互作用、TGF-β信号通路相关的基因定制靶向捕获测序芯片,利用Illumina Hi Seq X10进行高通量测序,对测序结果进行显著性基因分析(burden test)后得到与KD免疫相关的易感基因。研究结果:显著性基因分析发现发现7个免疫相关基因的单核苷酸变异(single nucleotide variation,SNV)集合在KD组与正常组之间存在显著差异(p<0.05)。其中CD84、IL-10及SMAD2基因与KD发病机制相关关系已有报道,PIK3CG、PRKCQ、PTPN6基因首次发现与KD发病相关。研究结论:CD84、ELF5、IL-10、PIK3CG、PRKCQ、PTPN6、SMAD2基因单核苷酸变异与KD发病相关。第二部分:LPS刺激川崎病外周血单核细胞免疫相关基因表达分析研究目的:体外培养刺激川崎病外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),观察KD免疫相关易感基因突变影响该基因表达情况,为进一步研究KD发病机理提供依据。研究方法:根据纳入标准选择在上海市儿童医院就诊的20名KD患儿和20名门诊健康查体的儿童作为研究对象,分为KD组及对照组。提取两组外周血单核细胞,细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激后分离细胞及培养液。提取细胞内RNA,利用RNA测序方法分析转录组水平差异,并将差异表达基因应用e QTL方法关联DNA测序结果分析,同时检测培养液中KD免疫调节相关的13项细胞因子,分析KD免疫调节相关易感基因表达差异情况。研究结果:1)RNA测序后对比分析发现6个异常表达基因与KD显著相关,其中mi RNA500、PLXND1与免疫系统发育及功能调控显著相关(P<0.01),GIT1及RUNX3与心血管系统发育显著相关(P<0.01)。2)e QTL关联DNA分析后发现在KD组中,受突变显著影响表达的基因有:PIK3CD(rs11121484)C/T(P=0.04),PIK3CD(rs1141402)G/A(P<0.01),ITPR3(rs2229634)C/T(P<0.01),PRKCZ(rs34108055)G/C(P=0.02),MAP2K1(rs1438386)G/A(P=0.01),ITGB2(rs2280965)C/T(P=0.03),mi RNA146b(rs943037)C/T(P=0.04)。3)与第一部分KD易感位点做交集分析后发现IL-10及PTPN6基因在KD组中存在影响该基因表达的单核苷酸变异(P<0.05)。4)LPS刺激后,KD组与对照组相比免疫调节细胞因子显著降低,SCD25(Z=-2.79,P=0.02),IL-10(Z=-3.10,P<0.01),IL-4(Z=-2.39,P=0.02)。研究结论:免疫调节相关基因及细胞分子在模拟炎症反应过程中表达差异显著,与KD发病相关。