神经干细胞（neural stem cells,NSCs）自被发现以来，因其特有的自我更新、多向分化潜能，较低的免疫原性等诸多优点而倍受神经科学界关注。但将 NSCs用于治疗疾病还存在很多亟待解决的问题。本研究采用原代细胞悬浮培养，改进传代培养中分离单细胞的方法，用EPO促进NSCs增殖，将GDNF基因导入神经干细胞，免疫荧光标记技术检测体外基因修饰神经干细胞向神经元的分化率，为该细胞的在体移植和临床应用提供依据。　　第一部分胚鼠脑源性神经干细胞的培养和鉴定　　目的：提高胚鼠脑源性神经干细胞克隆形成率，为GDNF基因修饰神经干细胞的制备和在体移植奠定基础。　　方法：　　第一步：胚鼠脑源性神经干细胞的分离培养　　取13~14d的SD胚鼠，剥离脑皮层，经漂洗、剪碎、吹打、过滤后采用无血清悬浮细胞培养。　　第二步：细胞传代　　原代培养6~7d后传代，分两组，一组采用逐步分批吹打法，另一组采用一次性吹打法，比较两组细胞生长状况。　　第三步：鉴定神经干细胞　　采用Nest in免疫荧光标记神经干细胞，荧光显微镜检测结果。　　第四步：检测神经干细胞分化情况　　传至3代的神经干细胞加血清诱导分化，第5d免疫荧光标记检测神经元的标志物NSE和星型胶质细胞的标志物GFAP。　　第五步：MTT法检测神经干细胞生长活力，绘制细胞生长曲线。　　第六步：检测促红细胞生成素对神经干细胞增殖影响　　两种吹打方法组传2代后，各组又分4个亚组，每亚组分别按0U/ml,50U/ml，100U/ml，150U/ml的浓度加入EPO，于培养第5d进行细胞计数，分析EPO对神经干细胞增殖的影响。　　结果：神经干细胞传代后从第3d增殖开始加快，4~6d增殖明显加快，然后处于相对稳定期。神经干细胞及其分化细胞免疫荧光鉴定呈阳性。逐步吹打组比一次性吹打组神经球大且数目相对多。培养液中加入EPO后，随剂量的增加，细胞增殖加快，逐步吹打组0U/ml、50U/ml、100U/ml和150U/mlEPO各剂量组神经干细胞记数分别为(33.96±6.54)×104个/ml、(36.67±7.77)×104个/ml、(43.13±8.43)×104个/ml和(51.04±10.62)×104个/ml。　　结论：成功培养了具有自我更新和多向分化潜能的神经干细胞；逐步分批吹打组细胞增殖快于一次性吹打组；EPO能促进神经干细胞的增殖及存活。　　第二部分GDNF基因修饰神经干细胞及其分化　　目的：获得转染GDNF基因的神经干细胞，检测此种细胞向神经元和星型胶质的分化率，为基因修饰神经干细胞的在体移植奠定基础。　　方法：　　第一步：质粒的提取　　将含peGFP-GDNF质粒的大肠杆菌接种入LB培养基培养，摇菌，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　第二步：脂质体法转染神经干细胞　　采用适合悬浮细胞的DMRIE-C Reagent脂质体转染试剂，将重组质粒peGFP-GDNF转染到胚鼠皮层神经干细胞。荧光倒置显微镜观察GFP蛋白的表达。第三步：GDNF基因修饰神经干细胞体外分化的检测　　分三组：第一组为阴性对照，第二组转染 peGFP-N1质粒组为阳性对照，第三组转染peGFP-GDNF质粒。各组于转染后第2d加入胎牛血清诱导细胞分化，7d后免疫荧光标记检测，分别计数各组神经元及星型胶质细胞个数，计算其分化率。结果：神经干细胞转基因后36小时目的基因开始表达，并逐渐增强，20天左右开始下降，基因的表达至少能维持到转染后5周。在阳性对照组和实验组转基因神经干细胞仍能增殖形成神经球，但与阴性对照组相比，增殖速度减慢，体积较小。转基因神经干细胞在血清诱导下能分化为神经元和神经胶质，神经元的分化率为(42.66±4.32)％，比未转染组和阳性对照组明显提高。　　结论：成功转染了神经干细胞；GDNF基因修饰的神经干细胞能较稳定表达外源基因；转染的GDNF基因抑制了神经干细胞的增殖，促进其向神经元分化。