蜘蛛丝具有无可比拟的优良性能,是具有分层结构的复合材料。关于蜘蛛丝蛋白的研究,一直以来都是科学研究者们关注的重点。由于蜘蛛高度的领土意识及侵略性,使得人工饲养蜘蛛具有一定的困难。本研究利用羊毛中的角蛋白相关蛋白基因Kap6.1作为启动子,将其与带有neo抗性的pcDNA3.1相连接构建真核表达载体,再利用本实验室前期合成的蜘蛛拖丝蛋白二聚体2S与其相连,构建可以启动蜘蛛拖丝蛋白的真核表达载体并转染绵羊皮肤成纤维细胞,经G418筛选出阳性细胞并扩大培养,建立转蜘蛛拖丝蛋白二聚体的绵羊皮肤成纤维细胞株,并为后续实验生产转基因绵羊奠定基础。研究结果与结论如下：1、真核表达载体的构建：双酶酶切去除pcDNA3.1自身的自启动子CMV,以同样的一对酶对Kap6.1进行酶切并与pcDNA3.1相连接,再与蜘蛛拖丝蛋白二聚体2S相连,成功构建真核表达载体Kap6.1-pcDNA3.1-2S。2、绵羊皮肤成纤维细胞的转染与筛选：将Kap6.1-pcDNA3.1-2S线性化后,用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,使用最适浓度的G418进行筛选,获得具有neo抗性的转基因阳性细胞。3、转基因阳性细胞的检测：对获得的转基因阳性细胞提取其基因组DNA,采用PCR方法进行检测,结果表明线性化Kap6.1-pcDNA3.1-2S成功整合到了绵羊皮肤成纤维细胞基因组中,并且转基因阳性细胞的形态及生长曲线与正常细胞一致,冷冻复苏后,转基因细胞仍保持正常的细胞形态和生长特性。综上所述,本研究成功获得了转Kap6.1-pcDNA3.1-2S的绵羊皮肤成纤维细胞株。