iRoot FS对成骨细胞和牙髓细胞生物学行为影响的初步研究

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生物陶瓷材料在牙髓病的治疗和预后中发挥着不可或缺的作用,特别在直接盖髓术和伴随骨缺损的根尖周炎治疗中。理想的盖髓材料和根管修复材料应该拥有良好的生物相容性、阻射性、操作方便性、良好的物理化学性能以及骨传导性。iRootFS是一种即用型纳米陶瓷生物材料,其突出特点是可以在短时间内固化且无需手动调拌,且不含对人体有害的元素,具有良好的生物相容性和生物活性。在根管修补或根尖手术中,iRootFS直接与骨组织接触或通过微循环与骨组织间接接触,因此iRoot FS对骨组织微环境的主要成分成骨细胞的影响是评估根尖倒充填材料的首要标准。直接盖髓术后,盖髓材料与暴露的牙髓直接接触使其维持活力并产生修复性牙本质的治疗手段。牙髓细胞是牙髓组织的主要成分,因此,研究盖髓材料在体内外对牙髓细胞的作用可以作为评估盖髓材料的生物相容性和对牙髓组织修复能力的体外模型。目前关于iRootFS对成骨细胞和牙髓细胞生物学行为的影响的体内外研究尚无报道,为了评估iRootFS作为直接盖髓材料和根管修复材料的安全性和功能性,本研究通过检测固化后iRoot FS对成骨细胞MC3T3-E1和牙髓细胞的生物学行为以及成骨/成牙本质向分化的影响来评估其体外生物相容性和生物活性,并与iRoot BP Plus和MTA进行比较。第一部分iRootFS影响成骨细胞生物学行为的体外研究目的:研究纳米生物陶瓷材料iRootFS对MC3T3-E1细胞的活性、凋亡、细胞骨架重构、材料贴附以及成骨向分化等生物学行为的影响。方法:使用iRoot FS、iRoot BP Plus和MTA材料浸提液对MC3T3-E1细胞进行培养。使用Cell counting kit-8(CCK-8,)试剂盒检测成骨细胞的活性和增殖情况,流式细胞术检测成骨细胞凋亡情况,免疫荧光染色观察成骨细胞骨架重构,扫描电镜下观察成骨细胞在材料表面的贴附。通过碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色、实时荧光定量PCR和Western blotting检测MC3T3-E1细胞的成骨向分化。结果:iRoot FS浸提液能够促进MC3T3-E1细胞的体外活性、细胞张力丝的形成以及细胞骨架重构,而且不引发细胞凋亡。MC3T3-E1细胞能够在iRootFS表明贴附并表现出良好的细胞形态。此外,iRootFS浸提液还能够促进MC3T3-E1的体外成骨向分化以及矿化结节的产生。结论:新型纳米生物陶瓷材料iRootFS在体外能够促进成骨细胞系MC3T3-E1细胞的体外活性、细胞骨架重构、贴附以及成骨向分化,其作用效果与iRootBPPlus和MTA相似。第二部分iRootFS影响牙髓细胞的生物学行为的体内外研究实验一:iRoot FS影响牙髓细胞生物学行为的体外研究目的:研究纳米生物陶瓷材料iRootFS对人牙髓细胞的体外活性、粘附、迁移和成牙本质向分化等生物学行为的影响,并探索iRootFS促进人牙髓细胞成牙本质向分化的分子机制。方法:使用iRoot FS、iRoot BP Plus和MTA材料浸提液对人牙髓细胞进行培养,并进行成牙本质向分化诱导。使用CCK-8试剂盒检测人牙髓细胞的活性和增殖情况。细胞—基质粘附实验评估牙髓细胞的粘附能力。划痕实验和Transwell迁移实验用来评价牙髓细胞水平及垂直迁移的能力。碱性磷酸酶活性测定、碱性磷酸酶染色检测人牙髓细胞中碱性磷酸酶的表达。茜素红染色检测人牙髓细胞分泌矿化结节的情况。细胞免疫荧光染色和Western blotting检测人牙髓细胞的成牙本质向的标志蛋白及分子机制相关蛋白的表达。结果:iRootFS浸提液能够促进人牙髓细胞的体外活性、粘附、迁移。iRootFS还能提高人牙髓细胞内碱性磷酸酶的活性、促进细胞分化产生矿化结节,并提高牙髓细胞成牙本质向分化相关蛋白的表达水平。此外,iRootFS还能刺激牙髓细胞表达AMPK/ERK信号轴相关蛋白,AMPK通路的阻断会减弱iRootFS对牙髓细胞成牙本质向分化的增强作用。结论:新型纳米生物陶瓷材料iRootFS能够促进人牙髓细胞的体外活性、粘附、迁移,并通过AMPK/ERK信号轴促进其成牙本向分化。实验二:iRootFS影响牙髓细胞生物学行为的体内研究目的:研究iRootFS直接盖髓后对大鼠体内牙髓细胞粘附、迁移和成牙本质向分化等生物学行为的影响。方法:使用iRootFS对大鼠上颌磨牙行直接盖髓术构建体内模型。术后14天后处死大鼠,分离上颌磨牙,进行MicroCT扫描,HE染色和Masson染色观察修复性牙本质的形成。利用免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色检测粘附、迁移、成牙本质向分化相关标志蛋白在组织中的表达情况,以及牙髓细胞成牙本质分化分子机制标志蛋白的表达。结果:使用iRootFS进行直接盖髓14天后,大鼠上颌磨牙盖髓处有修复性牙本质形成,可检测到牙髓细胞内粘附、迁移、成牙本质向分化相关标志蛋白p-FAK、p-Paxillin、OSX和DSP的表达。同时可检测到AMPK/ERK信号轴的相关蛋白p-AMPK和p-ERK的表达。结论:新型纳米生物陶瓷材料iRootFS能够在体内促进牙髓细胞的粘附、迁移,并通过激活AMPK/ERK信号轴促进牙髓细胞成牙本质向分化。
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