背景与目的胰腺癌是一种高度恶性,发展极为迅速的癌症,其预后差、死亡率高,特别是胰腺导管腺癌,五年生存率低于5%。胰腺癌在临床上往往依靠影像学检测,其所用诊断试剂盒特异性、准确性低,使其早期发现率低,鉴别诊断也非常困难。特别是近年来,胰腺癌发病率逐年上升。胰腺癌早期症状不明显,临床上尚无经济有效的早期发现方法。分子诊断学是近年发展迅速的新兴学科,目前已成为常用的临床诊断方法之一。小分子RNA(micro RNAs,miRNAs)能够在胰腺癌中特异性表达的特点使其可以作为胰腺癌的新型诊断标志物,相关的检测技术也随之不断发展。相关研究发现,mi RNA的抑制和上调对胰腺癌细胞的存活、增殖、侵袭、凋亡和转移有显著影响,其有望成为胰腺癌预测/预后的生物标记或诊断靶标。miRNA在真核生物中被发现,长约20~25个核苷酸,是内源性、具有调控功能的非编码RNA。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物(长达1000个核苷酸)经过双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha、Dicer的加工剪切而产生,随后被组装进RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),通过碱基互补配对的方式识别目标mRNA,可按照不同的互补程度指导沉默复合体降解目标mRNA或者阻遏目标mRNA的翻译。有相关研究表明,mi R-663可通过靶向TGF-β1抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究预实验结果显示,miR-663胰腺癌组织中miR-663的表达水平显著低于癌旁组织中miR-663的表达水平;利用生物信息学软件targetscan和diana-microt预测,结果显示真核细胞延长因子1-a2(eukaryoticelongationfactor1-a2,eef1a2)与mir-663在胰腺癌中具有相关性,eef1a2可能为mir-663作用靶标。本研究的目的在于了解mir-663在胰腺癌及癌旁组织中的表达情况,分析其与胰腺癌患者病理特征及生存期的相关性、过表达mir-663对胰腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡等特性的影响,初步验证mir-663作用靶标和调控机制。方法1.于2007年至2009年在郑州大学第一附属医院和河南省肿瘤医院收集了68例经历胰十二指肠切除术或胰腺导管末端切除术胰腺癌患者的癌组织和癌旁组织,置于液氮中保存。标本中eef1a2蛋白表达水平采用westernblot实验检测;mir-663和eef1a2mrna的表达水平采用荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,qrt-pcr)方法检测,并分析其与胰腺癌不同进展期和患者淋巴结转移情况的相关性。对上述所有胰腺癌患者随访,进行kaplan-meier生存分析,以判断胰腺癌的临床病理特征和患者生存期之间的相关性以及eef1a2和mir-663表达水平和患者生存期之间的关系。对正常胰腺细胞hpde6-c7及胰腺癌细胞panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3和aspc-1进行qrt-pcr检测,以观察mir-663的表达水平。对正常胰腺细胞hpde6-c7及胰腺癌细胞panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3和aspc-1进行westernblot实验,以观察eef1a2蛋白在细胞中的表达水平。2.将胰腺癌细胞panc-1和aspc-1分组进行转染。根据不同处理分为以下三组:a组为mir-663组,转染mir-663agomir和脂质体复合物;b组为nc组(阴性对照组),转染mir-663agomirnegativecontrol和脂质体复合物;c组为空白对照组(仅加入脂质体复合物)。细胞放置于细胞培养箱(37℃、5%co2)中培养备用。转染24h后对细胞的转染效果进行qrt-pcr检测。3.对a、b、c三组胰腺癌细胞进行cck-8实验及克隆形成实验以观察mir-663对胰腺癌细胞增殖的影响。4.移植瘤实验。分别将空白对照组和mir-663组panc-1胰腺癌细胞皮下注射入六周龄雄性balb/c裸鼠体内,并按照公式测量计算成瘤大小,对比差异。5.将阴性对照组和mir-663组胰腺癌细胞(panc-1和aspc-1)进行transwell实验以观察mir-663对细胞侵袭能力的影响。6.将阴性对照组和mir-663组胰腺癌细胞(panc-1和aspc-1)进行流式细胞术检测和hochest染色,以观察mir-663对胰腺癌细胞凋亡的影响。7.利用targetscan和diana-microt软件,以生物信息学方法分析并预测mir-663的作用靶点。构建野生及突变型eef1a2的3’utr区重组报告基因载体,将其与mir-663激动剂或mir-663agomirnegativecontrol共转染至胰腺癌细胞panc-1和aspc-1中,利用westernblot实验和双荧光素酶报告实验验证mir-663的作用靶点。8.回复实验。构建无3’utr区eef1a2的表达载体,仅转染或与mir-663agomir共转染入胰腺癌细胞panc-1和aspc-1中,通过回复实验的方法分析mir-663调控eef1a2表达的作用机制。9.下调eef1a2与上调mir-663对胰腺癌细胞作用效果比较。将eef1a2-sirnas和mir-663agomir转入胰腺癌细胞panc-1,比较二者对胰腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用效果。利用westernblot检测相关基因的表达。结果1.胰腺癌组织mir-663的表达水平明显低于癌旁组织(p<0.05),eef1a2mrna和蛋白表达水平明显高于癌旁组织(p<0.05),并且mir-663与eef1a2的表达水平呈负相关。eef1a2和mir-663的表达水平与胰腺癌tnm分期及患者的淋巴结转移状态显著相关(p<0.05)。kaplan-meier生存分析结果表明,胰腺癌患者的生存期与肿瘤直径(p<0.001)、分化程度(p<0.001)、临床分期(p<0.001)和淋巴结转移(p<0.001)显著相关,而和其性别(p=0.975)、年龄(p=0.523)和肿瘤位置(p=0.613)并无显著相关性。高表达eef1a2的胰腺癌患者其生存期更短,而高表达mir-663的胰腺癌患者其生存期更长(p<0.05),eef1a2和mir-663与胰腺癌患者的生存期相关。对不同细胞系hpde6-c7,panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3和aspc-1进行荧光定量pcr检测,结果显示,与正常胰腺细胞系hpde6-c7相比较,mir-663在胰腺癌细胞(panc-1,capan-2,sw1990,bxpc3andaspc-1)中被下调。可观察到其表达水平存在统计学差异(p<0.05)。westernblot实验结果显示,胰腺癌细胞中eef1a2蛋白表达水平显著高于正常胰腺细胞中eef1a2蛋白表达水平(p<0.05)。2.细胞转染后检测结果显示,mir-663在mir-663组中的表达水平明显高于blank组及nc组(p<0.05),表明胰腺癌细胞转染mir-663上调了mir-663的表达水平。3.cck-8实验显示,与空白对照组和阴性对照组相比较,mir-663组的panc-1细胞及aspc-1细胞,在第1、2、3天时在450nm处的吸光度值均下降,表明转染mir-663后,两种胰腺癌细胞的增殖水平均有显著降低。差异具有统计学意义(p<0.05)。克隆形成实验结果表明,mir-663组的克隆数明显少于空白对照组和阴性对照组。差异具有统计学意义(p<0.05)。4.移植瘤实验结果显示,过表达mir-663agomir的panc-1细胞注射入裸鼠体内后可抑制肿瘤生长。差异具有统计学意义(p<0.05)。5.transwell侵袭实验结果显示,mir-663组穿过基底膜的胰腺癌细胞数与nc组相比明显减少。数值差异具有统计学意义(p<0.05)。6.流式细胞术、hochest染色实验数据显示,与nc组相比,mir-663组胰腺癌细胞流式细胞术检测的凋亡数及荧光显微镜下的凋亡细胞数均显著增高,差异有统计学意义(p<0.05)。7.westernblot和双荧光素酶报告实验结果提示,eef1a2是mir-663的作用靶标。8.回复实验结果显示,mir-663作用于eef1a2的3’utr区,负向调控其表达,参与胰腺癌细胞的增殖、侵袭和凋亡。9.比较下调eef1a2与上调mir-663对胰腺癌细胞的作用效果及相关基因表达检测结果表明,下调eef1a2的作用与上调mir-663的作用类似,说明mir-663对于胰腺癌的抑制效应至少有一部分是由于作用于eef1a2而引起的。结论1.胰腺癌组织中miR-663表达水平异常降低,其表达水平与胰腺癌患者的淋巴结转移情况以及TNM分期有关。2.miR-663上调可有效抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭,促进胰腺癌细胞的凋亡。3.miR-663作用于eEF1A2的3’UTR区负向调控其表达水平,从而发挥其生物学效应。