目的:心室重构是许多心血管疾病进程中的重要的病理变化,是导致心力衰竭的主要因素之一。心室重构过程中心肌间质纤维化是其主要的病理形态改变,而心肌成纤维细胞又在纤维化起决定性作用。生理条件下,心肌成纤维细胞对于胶原的调控维持在正常水平;病理状态下,胶原的表达调控失调,细胞外基质过度沉积,导致心脏纤维化的发生。mi RNA是一类由mi RNA基因编码,长度约22个碱基的单链,不编码蛋白质的RNA,普遍参与细胞生理病理状态的调节,对细胞功能的维持发挥重要作用。在心室重构的过程中,mi R-26a-5p被发现存在表达差异,因此我们选择mi R-26a-5p,探讨其对心肌成纤维细胞的调控作用。通过靶基因预测软件预测ULK1可能是mi R-26a-5p调控的靶基因,为进一步研究其中的分子调控机制提供了思路。ULK1是自噬起始的关键因子,关于mi R-26a-5p与ULK1调控心脏纤维化的研究尚少,所以本研究将mi R-26a-5p对于ULK1基因的调控作为重点,进一步研究mi R-26a-5p对于纤维化的调控机制及自噬在该过程中所发挥的作用,为延缓乃至逆转心脏纤维化提供新的方向。方法:选择出生1~3天的Sprague Dawley新生小鼠,取出心脏的心室部,用组织块胰酶消化法消化心室组织,通过贴壁时间的差异分离纯化心肌成纤维细胞,在显微镜下观察细胞形态。细胞培养传至2~3代,消化接种于6孔板中,利用脂质体转染法将mi R-26a-5p mimic和inhibitor及其各自的对照转入心肌成纤维细胞中,48h后提取细胞RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR法检测mi R-26a-5p、ULK1m RNA相对表达;用Western blot法检测ULK1、LC3、I型胶原蛋白的表达水平。从Gen Bank中找出ULK1-3’UTR序列,根据结合位点的位置来设计野生型的PCR引物,经PCR扩增得到目的片段。将目的片段与双荧光素酶报告基因质粒pmir GLO双酶切后连接,获得野生型pmir GLO-ULK1-3’UTR-wt重组质粒,并根据该重组质粒构建突变型pmir GLO-ULK1-3’UTR-mut质粒。测序鉴定正确后将野生型和突变型ULK1-3’UTR质粒分别与mi R-26a-5p mimic及其对照共转入293T细胞,培养48h后,检测各组细胞的荧光素酶活性。结果:分离得到的心肌成纤维细胞,细胞贴壁后呈长梭形,无自主搏动;mi R-26a-5p mimic和inhibitor可以很好地模拟过表达和缺失的情况;随着mi R-26a-5p表达改变,ULK1基因在转录和蛋白水平也随之发生变化;心肌成纤维细胞转染mi R-26a-5p mimic后,LC3、I型胶原蛋白表达减少;反之转染inhibitor的细胞,LC3、I型胶原蛋白表达上升;在双荧光素酶报告实验中,共转野生型ULK1-3’UTR质粒和mi R-26a-5p mimic的细胞荧光素酶活性相比于其他组细胞明显下降,其他分组细胞中荧光素酶活性无明显差异。结论:在原代心肌成纤维细胞中,mi R-26a-5p通过负调控ULK1基因的表达影响细胞功能,进一步调节细胞自噬水平,从而使细胞I型胶原表达发生变化,进而发挥调节心脏纤维化的作用。