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EDA+FN是纤维连接蛋白(fibronectin, FN) mRNA的选择性剪接区域EDA(extra domain A)发生保留性剪接产生。近来研究表明,EDA在动脉粥样硬化中发挥着重要作用：在高脂饮食致动脉粥样硬化条件下,ApoE及EDA双基因敲除小鼠动脉粥样硬化程度较单一ApoE基因敲除小鼠明显减轻,而且EDA-/-ApoE-/-巨噬细胞内聚集的脂质也较对照的ApoE-/-巨噬细胞少。那么EDA+FN,是通过什么作用机制参与AS的发生发展?为研究EDA+FN是否通过诱发内质网应激而影响泡沫细胞的形成,探讨EDA+FN在动脉粥样硬化中的可能作用机制,本课题开展了如下研究：首先建立受四环素调控稳定表达EDA+FN和缺失EDA片段的EDA-FN的巨噬细胞系,为进一步在细胞水平研究EDA片段的功能提供实验基础。采用基因工程技术得到重组体pRevTRE/EDA+FN和pRevTRE/EDA-FN(pRevTRE是四环素调控反应质粒)。利用磷酸钙法将调节质粒(pRevTet-on)与辅助包装质粒(pGag/Pol、pVSV-G)共转染入病毒包装细胞293T,收集含病毒细胞上清经浓缩后感染小鼠巨噬细胞系Raw264.7,经过G418筛选,得到抗药细胞克隆,命名为McTet-on,采用相同方法将含目的基因的反应质粒(pRevTRE/EDA+FN和pRevTRE/EDA-FN)转入MCTet-on,经潮霉素筛选,有限稀释法收集潮霉素抗性细胞单克隆,分别命名为MCTeton/EDA+FN和MCTeton/EDA-FN。采用RT-PCR技术和免疫印迹技术对细胞进行鉴定,结果显示：MCTeton/EDA+FN和MCTeton/EDA-FN均在Dox诱导后表达FN蛋白(前者表达EDA+FN,后者表达EDA-FN)。综上所述,我们成功建立了四环素调控稳定表达EDA+FN和EDA-FN的巨噬细胞系。通过建立的细胞系本实验进行如下研究：收集Dox诱导0,24,48,72小时的MCTeton/EDA+FN和MCTeton/EDA-FN,免疫印迹技术检测内质网应激的标志物GRP78/BiP、CHOP的表达情况,结果显示GRP78/BiP表达在Dox诱导48h达高峰(P<0.01,n=3),诱导72h时还有表达；CHOP在Dox诱导72h才出现表达上调。作为对照的MCTeton/EDA-FN细胞组在相同处理条件下,GRP78/BiP和CHOP的表达并无明显变化,上述结果表明在Dox诱导EDA+FN高表达可诱发ERS,使UPR活化。同时应用实时荧光定量PCR方法检测固醇调控元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins, SREBPs)在Dox诱导0,24,48,72小时的mRNA水平表达变化,发现SREBP-1在Dox诱导不同时间表达变化不明显,而SREBP-2随诱导时间延长表达上调,诱导48h时表达上调3.4倍(P<0.01,n=5),这一结果提示SREBP-2的表达上调可能由ERS所诱发。采用油红0染色、LDL摄取实验及脂质测定实验检测在Dox诱导0,48小时的MCTeton/EDA+FN在泡沫细胞形成、脂质摄取和合成方面有无变化,结果显示EDA+FN高表达的巨噬细胞在脂质摄取能力和细胞中胆固醇的含量(较对照组升高1.86倍,P<0.05,n=3)均明显增高,细胞中甘油三酯的含量变化不明显。进一步利用ERS/UPR抑制剂PBA处理,发现上述内质网伴侣分子GRP78/BiP不再随Dox的诱导发生表达上调并且出现MCTeton/EDA+FN对脂质的摄取减少,胞内胆固醇的含量较对照组无明显增加,SREBP-2在有抑制剂PBA存在时,其由EDA+FN高表达诱发的表达上调被减弱(诱导48h时表达仅上调2.2倍,P<0.05,n=5),上述结果提示EDA+FN诱发的ERS/UPR可能通过激活SREBP-2对脂质代谢产生影响从而促进泡沫细胞形成。综上所述,本实验成功建立四环素调控稳定表达EDA+FN和EDA-FN的巨噬细胞系。首次提出EDA+FN的高表达可诱发ERS,初步证实EDA+FN诱发的ERS/UPR可能通过激活SREBP-2,从而增强脂质的摄取和合成能力产生促进泡沫细胞形成的作用,为进一步阐明EDA+FN在动脉粥样硬化中的可能作用机制提供了实验依据。